M1 细胞：生命的基本单位

本模块你将学会

学完后，回到这里检查自己能否做到每一条。

• 建立微观世界的尺度感，知道光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜和流式细胞术各能看什么
• 说出所有细胞的共同特征，解释病毒为什么不算细胞
• 说清原核细胞与真核细胞的区别；认识细菌的细胞壁、外膜和内毒素，以及线粒体从哪里来
• 认识真核细胞的主要细胞器，并说出它们的分工
• 理解细胞膜的结构、物质跨膜运输的方式和渗透作用，知道质粒和 mRNA 怎样被送进细胞
• 用概念层面的语言讲清 ATP、有氧呼吸、乳酸发酵和细胞信号转导
• 讲清一个分泌蛋白（如抗体）在细胞内的"生产流水线"，以及为什么抗体要用哺乳动物细胞生产
• 理解细胞周期、有丝分裂、减数分裂、干细胞和细胞死亡，知道癌症与细胞周期失控的关系
• 掌握细胞培养的基本概念：培养条件、传代、污染、计数与活率、冻存、细胞库、生长曲线
• 比较大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、CHO、HEK293 五种表达宿主，并说明理由

01尺度与观察工具：细胞有多小？怎么看见它？

生物学里最常见的三个长度单位：毫米（mm）、微米（μm）、纳米（nm）。

先记住换算关系：1 毫米 = 1000 微米，1 微米 = 1000 纳米。也就是说，1 毫米 = 100 万纳米。微米的符号 μm 里的 μ 读作"缪"，来自希腊字母；纳米的"纳"是英文 nano 的音译，意思是十亿分之一（1 nm = 10^-9 米）。

用这把"尺子"来量一量生物学里的常见对象：人体典型细胞直径约 10–100 μm，细菌通常 1–5 μm，病毒大多在 20–300 nm 之间，一个蛋白质分子只有几到十几纳米，DNA 双螺旋的直径约 2 nm。相邻两级之间往往差 10 到 100 倍。所以说"细菌比细胞小、病毒比细菌小、蛋白比病毒小"，每一步都是一个数量级的跨越。

人的肉眼大约能分辨 0.1 毫米（100 μm）的东西，所以绝大多数细胞单个都看不见（我们能看到的是成千上万个细胞堆在一起，比如培养瓶底的一层"白膜"、平板上的一个菌落）。要看清细胞，就需要显微镜。

37 万亿来自 Bianconi 等人 2013 年的估算；其余为教科书常见数值。

观察工具一：光学显微镜

光学显微镜（light microscope）用可见光照明，用玻璃透镜放大，最高放大约 1000–1500 倍。决定"能看多清"的不是放大倍数，而是分辨率：能把两个相邻的点区分开的最小距离。由于可见光的波长约 400–700 nm，光学显微镜的分辨极限大约是 0.2 μm（200 nm）。比这更近的两个点，放得再大也只是一团模糊。

所以光学显微镜能看清细胞、细胞核，也能看到细菌（1–2 μm）的形状，但看不清大多数病毒（几十到一两百纳米），更看不到核糖体和蛋白质。细胞培养室里每天用的是倒置相差显微镜：物镜在培养瓶下方，不用染色就能看清活细胞的轮廓，用来判断细胞长满了没有、形态是否正常、有没有污染。

观察工具二：电子显微镜

电子显微镜（electron microscope，电镜）用电子束代替光，电子的波长比可见光短得多，分辨率可以达到纳米甚至更小，能看清病毒、细胞器的内部结构和大的蛋白复合物。电镜主要有两种：

• 透射电镜（TEM）：电子束穿过极薄的样品切片，得到内部结构的"剖面图"。课本里线粒体的嵴、内质网上的核糖体，大多是透射电镜拍的。
• 扫描电镜（SEM）：电子束在样品表面逐点扫描，得到立体感很强的表面形貌图，比如细菌的鞭毛、细胞表面的突起。

电镜的代价是：样品必须固定、脱水并放进真空中观察，所以看不了活细胞；图像本身是黑白的（彩色图是后期上色）。近年来发展的冷冻电镜把样品快速冻在极薄的冰层里观察，可以解析蛋白质的三维结构，2017 年获得诺贝尔化学奖（M5 讲蛋白结构时会再提到）。

观察工具三：荧光显微镜与荧光蛋白（GFP）

普通显微镜下，细胞里的大多数分子都是透明的，分不清谁是谁。荧光显微镜（fluorescence microscope）解决的是"看特定分子在哪里"的问题：荧光分子吸收一种颜色的光（例如蓝光）后，会发出另一种波长更长的光（例如绿光）。只要给目标分子"贴"上荧光标记，在黑暗背景下就只看到它发光。

贴标记的方式主要有两种：一是用连着荧光染料的抗体去结合目标蛋白（叫免疫荧光，抗体在 M6 详讲）；二是用绿色荧光蛋白（GFP）。GFP 最早从一种水母中发现，2008 年获得诺贝尔化学奖。把 GFP 的基因和目标蛋白的基因连在一起，细胞就会自己生产"带绿灯的目标蛋白"，在活细胞里也能实时看到它跑到哪里。后来人们又改造出了红、黄、蓝等多种颜色的荧光蛋白。

观察工具四：流式细胞术

显微镜一次只能看一个视野、几十上百个细胞，很难精确回答"这群细胞里有百分之几是绿色的"。流式细胞术（flow cytometry）换了一种思路：让悬浮的细胞排成单行，一个接一个高速流过激光束，仪器逐个记录每个细胞散射的光和发出的荧光，每秒可以分析成千上万个细胞。

• 散射光：前向散射大致反映细胞大小，侧向散射大致反映细胞内部的复杂程度（颗粒多不多），可以用来区分不同类型的细胞和碎片。
• 荧光：用荧光抗体标记细胞表面的某种蛋白，就能统计"有多少比例的细胞表达这种蛋白、表达有多强"。同时用几种颜色，就能同时看几种蛋白。
• 分选：带分选功能的流式细胞仪（常叫 FACS）还能把符合条件的细胞单独挑出来收集。

为什么在工作中经常听到"流式"？因为它是细胞领域的通用"计量工具"：测转染效率（GFP 阳性比例）、验证抗体能否结合细胞表面的靶点、给免疫细胞分型、检测 CAR-T 细胞的 CAR 表达率、区分活细胞和凋亡细胞，都离不开它。客户说"我们要做流式验证"，通常就是用荧光标记的抗体去检测细胞表面的某个蛋白。

02细胞学说与细胞的共同特征：病毒为什么不算细胞

三百年的观察归纳成三句话，再看看所有细胞共有的"标准配置"。

细胞学说的三个核心观点

1. 所有生物都由一个或多个细胞构成；
2. 细胞是生物体结构和功能的基本单位；
3. 细胞只能由已存在的细胞分裂产生。

有的生物只有一个细胞（细菌、酵母），这一个细胞就要完成吃、长、繁殖等所有工作；有的生物由大量细胞构成（植物、动物、人），细胞之间有分工。多细胞生物的结构层次是：细胞 → 组织 → 器官 → 系统 → 个体。例如很多肌肉细胞构成肌肉组织，几种组织构成心脏这个器官，心脏和血管构成循环系统。

所有细胞都有的"标准配置"

地球上的细胞形态千差万别，但无论是大肠杆菌、酵母还是人体细胞，都具备下面这几样东西。正是它们让细胞成为能独立生存的最小生命单位：

病毒为什么不是细胞？

病毒（virus）常被拿来和细菌相提并论，但它们是完全不同的东西。一个病毒颗粒的结构非常简单：

• 遗传物质：DNA 或 RNA（一种病毒只用其中一种），携带制造新病毒所需的基因；
• 衣壳：由蛋白质组成的外壳，保护里面的遗传物质；
• 包膜（只有部分病毒有）：衣壳外面再裹一层脂质膜，这层膜其实是病毒离开宿主细胞时"借走"的一块宿主细胞膜，上面插着病毒自己的糖蛋白（例如新冠病毒的刺突蛋白）。

对照上面的"标准配置"就能看出：病毒没有细胞膜包围的细胞质，没有核糖体，没有代谢系统，不能自己产生能量，也不能靠分裂繁殖。病毒离开宿主时就像一粒"种子"，什么也不做；只有进入合适的宿主细胞后，才能借用宿主的核糖体、酶、原料和能量来复制自己。一个典型的感染过程是：

1. 吸附：病毒表面的蛋白结合宿主细胞膜上特定的受体（这决定了病毒能感染哪些细胞）；
2. 进入：病毒或它的遗传物质进入细胞；
3. 复制与合成：宿主细胞的"工厂"被劫持，按病毒基因复制病毒遗传物质、生产病毒蛋白；
4. 组装与释放：新的病毒颗粒组装好后离开细胞，有的会让宿主细胞破裂死亡。

所以病毒是"严格的细胞内寄生物"，通常被看作处在生命边缘的存在，不属于细胞学说里的"细胞"。专门感染细菌的病毒叫噬菌体。也因为病毒没有细菌的那些结构，抗生素对病毒无效（抗生素攻击的是细菌的细胞壁、70S 核糖体等，第 04 节讲）。

03两种基本"户型"：原核细胞与真核细胞

地球上所有细胞，按有没有细胞核分成两大类。

"核"指细胞核：一个由双层膜（核膜）包起来、专门存放 DNA 的结构。原核细胞（prokaryote）的"原"是"原始、在细胞核出现之前"的意思，它的 DNA 没有核膜包裹；真核细胞（eukaryote）则有"真正的"细胞核。细菌和古菌是原核生物；酵母等真菌、植物、动物和人是真核生物。

除了细胞核，真核细胞内部还被膜分隔成许多有专门功能的小隔间，叫细胞器（organelle），例如线粒体、内质网、高尔基体。原核细胞没有这些膜包裹的细胞器，所有反应都在同一个"大房间"里进行。真核细胞通常也大得多，体积往往是细菌的上千倍，正是靠内部分区，才能在这么大的空间里有条不紊地工作。

S 是沉降系数单位，表示颗粒在离心时沉降的快慢，数字越大颗粒越大；70S、80S 不是简单相加的关系。

值得注意的是，原核和真核共有的东西也很多：都有细胞膜、细胞质、核糖体，都用 DNA 储存遗传信息、用同一套遗传密码。两者最本质的区别只有一条：有没有被核膜包裹的细胞核（以及随之而来的膜包裹细胞器）。

原核生物里除了细菌，还有一类叫古菌的微生物，外形像细菌，但在分子层面与细菌差别很大，常生活在高温、高盐等极端环境。生物学家据此把所有细胞生命分成三大"域"：细菌、古菌、真核生物。工作中接触的原核生物基本都是细菌，下一节就专门讲细菌。

04原核细胞详解：细菌身上的每个零件都与工作有关

以实验室最常用的大肠杆菌为例，从里到外看一个细菌。

大肠杆菌（E. coli）是一种杆状细菌，长约 1–2 μm、宽约 0.5 μm。实验室用的是经过改造、不致病的菌株（如 K-12、BL21 等衍生菌株）。它结构简单，却几乎每个部位都和基因合成、质粒生产、蛋白表达有直接联系。

拟核：一条环状染色体

细菌的主要遗传物质是一条环状的 DNA 分子，叫细菌染色体。大肠杆菌的染色体约有 460 万个碱基对、4000 多个基因。它没有核膜包裹，而是盘绕压缩后聚集在细胞中央的一片区域，叫拟核（nucleoid）。因为没有核膜，细菌的转录和翻译都在细胞质里进行，mRNA 一边转录、核糖体一边就能开始翻译（M3 详讲）。

质粒：基因工程的"运输车"

很多细菌除了染色体，还带有一些小得多的环状 DNA，叫质粒（plasmid）。质粒有几个关键特点：

• 独立复制：质粒有自己的复制起点（ori），能独立于染色体自我复制，一个细菌里常常有多个甚至几百个拷贝；
• 体积小：实验室常用的质粒多为几千个碱基对，远小于染色体，容易提取和操作；
• 携带"额外技能"：天然质粒常带有抗生素抗性等基因，对细菌生存有利但不是必需的；
• 可以在细菌之间传递：这是耐药基因在细菌中扩散的重要途径。

科学家把质粒改造成标准化的载体：在上面装上目的基因、抗生素抗性筛选基因和表达所需的元件，把它送进大肠杆菌，细菌每分裂一次质粒就跟着复制，于是可以大量生产。金斯瑞的基因合成交付物，通常就是装在质粒里的基因（M4 详讲质粒的结构和构建）。

核糖体：70S，抗生素的靶点

细菌的核糖体是 70S，由 50S 大亚基和 30S 小亚基组成；人类细胞质里的核糖体是 80S。两者结构上的差异，让很多抗生素（如链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素）能专门卡住细菌核糖体、阻止细菌合成蛋白，而对人的核糖体影响很小。这种"只打细菌、不伤人"的特性叫选择性毒性。

细胞壁：肽聚糖做的"铠甲"

细菌细胞膜外面还有一层坚韧的细胞壁，主要成分是肽聚糖（peptidoglycan）：由长长的糖链和短肽交叉连接成的一张网，像一层编织紧密的网兜罩在细胞外面。它的作用是维持细菌的形状，并抵抗渗透压：细菌内部溶质浓度高，水会不断往里渗，如果没有细胞壁撑着，细菌就会涨破（渗透作用在第 08 节详讲）。

人的细胞没有细胞壁，更没有肽聚糖，所以针对细胞壁的抗生素对人相对安全。例如青霉素、氨苄青霉素会阻止细菌合成新的肽聚糖交联，正在生长的细菌细胞壁变得不牢固，最终涨破死亡。实验室里还常用溶菌酶来破坏肽聚糖，帮助裂解细菌、提取里面的蛋白或质粒。

革兰氏阳性菌与阴性菌：外膜与脂多糖

1884 年，丹麦医生革兰发明了一种染色方法，至今仍是给细菌分类的第一步：先用紫色的结晶紫染色，再用酒精冲洗，最后用红色染料复染。结果细菌分成两类：

• 革兰氏阳性菌（G⁺）：肽聚糖层很厚（多层），结晶紫被"锁"在里面，酒精洗不掉，显紫色。例如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。
• 革兰氏阴性菌（G⁻）：肽聚糖层很薄，外面还多了一层外膜（outer membrane）；酒精一洗结晶紫就流失，最后被复染成红色。大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌都是阴性菌。

阴性菌外膜的外层布满了一种特殊分子：脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。它由一段脂质（叫脂质 A）连着一长串糖链构成，就像无数根"棒棒糖"插在细菌表面。LPS 就是大名鼎鼎的内毒素（endotoxin），"内"是因为它是细菌自身结构的一部分，在细菌死亡裂解时大量释放出来。

内毒素为什么让人头疼？

• 极微量就有强烈作用：人的免疫系统对 LPS 极其敏感，把它当作"有细菌入侵"的警报。进入血液后会引起发烧、炎症，量大时可导致休克。
• 细菌死了它还在：内毒素不是活的东西，过滤除菌、杀死细菌都去不掉它；它也很耐热，常规的高压蒸汽灭菌不能使它失活。所以"无菌"不等于"无内毒素"。
• 会干扰细胞实验：内毒素会激活免疫细胞、影响很多细胞的状态，还会降低一些敏感细胞的转染效率。

细胞外的附属结构：荚膜、鞭毛、菌毛

细菌怎样繁殖：二分裂

细菌没有有丝分裂那套复杂的机器，而是用一种简单高效的方式繁殖，叫二分裂（binary fission）：

1. 细菌从染色体上唯一的复制起点开始复制 DNA，得到两份完全相同的染色体；
2. 细菌长大、拉长，两份染色体被分到细胞两端；
3. 细胞中部的膜和细胞壁向内生长，形成隔板，把细胞一分为二，得到两个遗传上相同的子细胞。

条件理想时（营养丰富、37 °C），大肠杆菌大约 20 分钟就能分裂一次。质粒也会随着细菌一起复制并分到子细胞里，所以培养一夜，就能从一个细菌得到数以亿计带着同样质粒的细菌，这就是用细菌"大量生产质粒"的原理（生长速度和生长曲线在第 15 节详讲）。二分裂是无性繁殖，子细胞与母细胞几乎一模一样；细菌的遗传多样性主要来自突变，以及通过质粒传递、吸收环境中的 DNA 等方式获得外来基因。实验室把质粒"送进"细菌的转化操作，正是利用了细菌能吸收外来 DNA 的特点（M4 详讲）。

05走进真核细胞：各个细胞器怎么分工

先读正文认识每个"部门"，再用互动图和配对练习巩固。

真核细胞像一座分工精细的工厂。下面按"信息中心 → 生产线 → 物流与回收 → 能量 → 骨架"的顺序，逐个认识主要的细胞器。其中内质网、高尔基体、溶酶体、囊泡和核膜在结构上彼此相连或通过囊泡来往，合称内膜系统，它们共同负责蛋白质和脂质的加工与运输。细胞器之间充满的胶状液体叫细胞质基质，很多代谢反应（例如糖酵解，第 09 节）就在这里进行。

信息中心：细胞核与核仁

细胞核（nucleus）是细胞里最大的细胞器，直径通常约 5–10 μm，保存着细胞几乎全部的 DNA。它有三个关键部件：

• 核膜：由内外两层膜构成，外层膜与内质网相连。核膜把 DNA 和细胞质隔开，使真核细胞的转录（在核内）和翻译（在核外）分在两个地方进行。
• 核孔：核膜上有数千个由蛋白质构成的精密"闸门"，控制大分子进出：mRNA 和核糖体亚基从核内出去，DNA 聚合酶、组蛋白等在细胞质合成的蛋白从核外进来。
• 染色质：DNA 缠绕在组蛋白上形成的复合物。平时它是松散的细丝，便于读取基因；细胞分裂时高度压缩成短粗的染色体，便于搬运（第 12 节）。人体细胞核里的 DNA 拉直后约 2 米长。

细胞核里还有一个染色较深的区域，叫核仁（nucleolus）。它没有膜包裹，是合成核糖体 RNA（rRNA）、组装核糖体大小亚基的"零件厂"。蛋白合成越旺盛的细胞，核仁通常越明显。

生产线：核糖体与内质网

核糖体（ribosome）由 rRNA 和蛋白质构成，没有膜包裹，是读取 mRNA、把氨基酸连成蛋白质的机器（M3 详讲）。真核细胞里的核糖体有两种"工位"：

• 游离核糖体：散在细胞质基质中，主要生产留在细胞质里自己用的蛋白，例如代谢用的酶；
• 附着核糖体：附着在内质网表面，主要生产要分泌到细胞外的蛋白（如抗体）、细胞膜上的蛋白和溶酶体里的酶。

两种核糖体本身是一样的，决定它去哪儿工作的是正在合成的蛋白：如果蛋白链开头带有一段"信号肽"，核糖体就会被拉到内质网上（第 11 节详讲）。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是由膜围成的管道和扁平囊组成的网络，从核膜一直延伸到细胞质各处，是细胞里面积最大的膜系统。它分两种：

• 粗面内质网（RER）：表面附着大量核糖体，在电镜下看起来"粗糙"。分泌蛋白和膜蛋白一边合成一边进入它的内腔，在这里折叠成正确的形状、形成二硫键、开始糖基化（挂上糖链），并接受"质量检查"，折叠错误的蛋白会被降解。
• 光面内质网（SER）：没有核糖体，负责合成脂质（包括构成细胞膜的磷脂和类固醇激素），在肝细胞中参与药物和毒物的解毒，在肌肉细胞中储存钙离子。

专门分泌抗体的浆细胞（一种免疫细胞），细胞质里几乎塞满了粗面内质网；CHO 细胞被改造成抗体"高产细胞"后，内质网也会明显扩张。

物流中心：高尔基体与囊泡

高尔基体（Golgi apparatus）由一叠扁平的膜囊组成，像一摞微微弯曲的盘子。它有方向性：靠近内质网的一面负责"收货"，另一面负责"发货"。从内质网来的蛋白在高尔基体里继续加工（例如修剪和完善糖链），然后按蛋白上的"地址标签"分拣，打包进不同的囊泡，送往细胞膜、溶酶体，或分泌到细胞外。

囊泡（vesicle）是由膜包起来的小泡，是细胞内的"快递包裹"：它从一个膜结构上"出芽"脱落，装着货物沿细胞骨架运输，再与目的地的膜融合，把货物交出去。内质网到高尔基体、高尔基体到细胞膜的运输都靠囊泡。有的分泌囊泡会一直释放（如抗体分泌），有的则先储存、接到信号才释放（如胰岛素、神经递质）。

回收与解毒：溶酶体与过氧化物酶体

溶酶体（lysosome）是单层膜包裹的小泡，内部呈酸性（pH 约 4.5–5），装着几十种能分解蛋白质、核酸、脂质和多糖的消化酶。它负责消化细胞吞进来的物质（例如免疫细胞吞掉的细菌），也负责分解衰老、损坏的细胞器，把原料回收再利用，这个"自我消化"的过程叫自噬（2016 年诺贝尔生理学或医学奖）。如果溶酶体里先天缺少某种酶，相应的物质就会堆积，导致"溶酶体贮积症"；其中一些疾病的治疗方法是定期注射用细胞生产的重组酶（酶替代疗法）。

过氧化物酶体（peroxisome）也是单层膜小泡，负责分解脂肪酸、对一些有毒物质进行氧化解毒。这些反应会产生有害的过氧化氢（H₂O₂），过氧化物酶体里的过氧化氢酶会立刻把它分解成水和氧气。肝脏和肾脏细胞里的过氧化物酶体特别多。

能量中心：线粒体

线粒体（mitochondrion）是细胞的"发电厂"，通过有氧呼吸把糖和脂肪中的化学能转化为 ATP（细胞的"能量货币"，第 09 节详讲）。它有两层膜：外膜光滑，内膜向内折叠成许多"嵴"，大大增加了面积，产生 ATP 的关键反应就发生在内膜上；内膜包围的空间叫基质。一个细胞里的线粒体从几个到上千个不等，耗能多的细胞（如心肌、肝细胞）线粒体特别多。

线粒体有一个特别之处：它有自己的环状 DNA 和自己的核糖体，能自己分裂增殖。这些"像细菌一样"的特征，是第 06 节内共生学说的关键证据。线粒体还参与细胞凋亡的启动（第 14 节）。

骨架与运输轨道：细胞骨架和中心体

细胞并不是一袋随便晃动的液体，里面有一套由蛋白纤维搭成的支架，叫细胞骨架（cytoskeleton）。它维持细胞形状、帮助细胞运动，还是囊泡和细胞器运输的"轨道"。细胞骨架有三种纤维：

中心体（centrosome）位于细胞核附近，是动物细胞组织微管的中心，含一对互相垂直的中心粒。细胞分裂前中心体复制成两个，分别移到细胞两端，发出微管组成纺锤体，把复制好的染色体平均拉向两个子细胞（第 12 节）。高等植物细胞没有中心粒，但同样能形成纺锤体。

互动：点一点动物细胞

下面的互动图是上文内容的复习版，点击图中的结构查看它的"角色卡"。全部看完会有提示。

汇总表：一张表记住所有细胞器

植物细胞多了什么？

反过来，高等植物细胞没有中心粒，溶酶体也不典型。下表把四类常见细胞放在一起比较，工作中遇到的表达宿主（大肠杆菌、酵母、CHO）分别对应其中三列：

06内共生学说：线粒体曾经是一个细菌

真核细胞的"发电厂"从哪里来？答案藏在线粒体自己的 DNA 里。

线粒体和叶绿体在真核细胞里显得很"另类"：它们有两层膜，有自己的 DNA，还能自己分裂。为了解释这些现象，科学家提出了内共生学说（endosymbiotic theory），20 世纪 60 年代由美国生物学家琳·马古利斯系统阐述并推广，如今已是主流共识。

故事是这样的

1. 大约十几亿年前，一个较大的古老细胞（宿主）把一个能利用氧气高效产能的细菌吞了进去；
2. 这个细菌没有被消化，而是在宿主体内活了下来：细菌为宿主提供大量能量，宿主为细菌提供保护和原料，双方互利共生；
3. 经过漫长的演化，细菌的大部分基因转移到了宿主的细胞核里，它再也无法独立生活，变成了今天的线粒体；
4. 后来，一部分已经拥有线粒体的细胞又吞进了能进行光合作用的蓝细菌，它演变成了叶绿体，这些细胞的后代就是藻类和植物。

有哪些证据？

不过，今天的线粒体已经离不开细胞了：它自己的 DNA 只编码极少数蛋白，构成线粒体的上千种蛋白绝大多数由细胞核基因编码，在细胞质中合成后再运进线粒体。这正说明了"基因从共生菌转移到宿主细胞核"的演化过程。

07细胞膜：流动的"城墙"

理解细胞膜，就能理解药物如何作用于细胞、基因如何被送进细胞。

磷脂双分子层：油和水的智慧

细胞膜的基本骨架是磷脂（phospholipid）。一个磷脂分子像一根"火柴"：一头是含磷酸基团的亲水头部，喜欢和水接触；另一头是两条由脂肪酸构成的疏水尾部，像油一样怕水。这种"一头亲水、一头疏水"的分子叫两亲分子。

把磷脂放进水里，它们会自发排成两层：亲水的头部朝外，分别面向细胞外液和细胞内的细胞质；疏水的尾部两两相对，藏在膜的中间，避开水。这就是磷脂双分子层（lipid bilayer），厚度只有约 5–10 nm。磷脂还能自发卷成一个个封闭的小球，叫脂质体，这是后面要讲的转染试剂和 LNP 的基础。

流动镶嵌模型

1972 年提出的流动镶嵌模型（fluid mosaic model）是今天描述细胞膜的标准模型，名字里的两个词各有含义：

• 流动：膜不是一堵固定的墙，而更像一层薄薄的油膜。磷脂分子可以在本层内快速横向移动，很多膜蛋白也能在膜上"漂移"。正因为膜是流动的，囊泡才能与膜融合（胞吐）、膜才能内陷包裹物质（胞吞），细胞才能变形、分裂。
• 镶嵌：各种蛋白质像马赛克一样镶嵌在磷脂"海洋"里。有的蛋白贯穿整个膜（跨膜蛋白），两端分别露在细胞内外；有的只附着在膜的一侧表面。

动物细胞膜里还插着不少胆固醇分子，它们嵌在磷脂之间，像"调节阀"一样调节膜的流动性：温度高时防止膜太稀太软，温度低时防止膜太僵硬。植物细胞膜里是结构类似的植物固醇，细菌的膜一般不含胆固醇。顺便一提，mRNA 疫苗用的 LNP 配方里，胆固醇也是四种组分之一。

膜蛋白：膜的功能主要靠它们

磷脂负责"隔开"，具体的工作大多由膜蛋白完成。按功能可以分成几类：

08物质进出细胞：跨膜运输、渗透作用与基因递送

什么能进、什么不能进、靠什么进，决定了细胞怎样吃饭，也决定了我们怎样把质粒和 mRNA 送进细胞。

细胞膜是选择透过性的：有的物质能自由穿过，有的要靠特定的蛋白帮忙，有的必须"整包"运进运出。理解跨膜运输，先要理解一个概念：浓度梯度。如果膜一侧某种物质多、另一侧少，这种物质就有从多的一侧向少的一侧扩散的自然趋势，就像一滴墨水在水里慢慢散开。顺着浓度梯度移动不需要细胞花能量，叫被动运输；逆着浓度梯度"往高处搬"，就需要消耗能量，叫主动运输。

被动运输一：简单扩散

简单扩散（simple diffusion）是指物质直接穿过磷脂双分子层，从高浓度一侧移到低浓度一侧，不需要蛋白质帮忙，也不消耗能量。能这样通过的，是小而不带电或脂溶性的分子：氧气（O₂）、二氧化碳（CO₂）、乙醇，以及类固醇激素等。原因很简单：膜中间是疏水的"油层"，只有不怕油的分子才能溶进去穿过。

被动运输二：协助扩散

离子（如 Na⁺、K⁺）带电，葡萄糖、氨基酸是极性分子，都很难直接穿过油层。它们顺浓度梯度进出细胞时，需要膜蛋白帮忙，这叫协助扩散（facilitated diffusion），同样不消耗能量。帮忙的蛋白有两种：

• 通道蛋白：在膜上形成一条亲水的孔道，只允许特定的离子或分子通过，速度极快。很多通道有"门"，接到信号才开放（神经信号就靠离子通道的开关）。水分子虽然能少量直接穿过磷脂层，但大量的水是通过专门的水通道蛋白进出细胞的。
• 载体蛋白：先与特定分子结合，然后改变形状，把它从膜的一侧"翻"到另一侧，像一扇旋转门。例如红细胞通过葡萄糖转运体吸收血液中的葡萄糖。

主动运输：逆流而上，要花 ATP

有时细胞需要把物质从低浓度一侧运到高浓度一侧，这时就要消耗能量，叫主动运输（active transport），由一类叫"泵"的载体蛋白完成。最经典的例子是钠钾泵（Na⁺/K⁺ 泵）：每消耗 1 个 ATP，就把 3 个 Na⁺ 泵出细胞、2 个 K⁺ 泵进细胞。结果是细胞内 K⁺ 多、Na⁺ 少，细胞外正好相反。这个浓度差非常重要：它是神经和肌肉产生电信号的基础，帮助细胞维持体积，还能为其他物质的运输"供能"（例如小肠细胞借助 Na⁺ 顺浓度差流入的力量，把葡萄糖一起带进来）。动物细胞相当一部分 ATP 都花在了钠钾泵上。

大块头怎么进出：胞吞与胞吐

蛋白质、病毒颗粒、细菌这样的大东西，不可能通过通道或载体。细胞的办法是动用膜本身：

• 胞吞（endocytosis）：细胞膜向内凹陷，把外面的物质包起来，再"掐断"成一个囊泡进入细胞。免疫细胞（如巨噬细胞）吞噬整个细菌叫吞噬作用；很多分子先结合在膜上特定的受体上，再被成批吞入，叫受体介导的胞吞。很多病毒、LNP 和抗体偶联药物都是通过胞吞进入细胞的，进去后往往被送到溶酶体。
• 胞吐（exocytosis）：细胞内装着货物的囊泡移动到细胞膜，与膜融合，把货物释放到细胞外。抗体、胰岛素等分泌蛋白和神经递质都是这样被释放的（第 11 节）。

胞吞和胞吐都要消耗能量，而且都依赖膜的流动性。

渗透作用与渗透压：细胞为什么会涨破或皱缩

水的运动有一个专门的名字：渗透作用（osmosis），指水分子透过选择透过性膜，从溶质浓度低（水多）的一侧向溶质浓度高（水少）的一侧移动。可以理解为"水往盐多的地方跑"，去稀释浓的一侧。溶液"吸水"能力的强弱用渗透压来衡量：溶质颗粒越多，渗透压越高，吸水能力越强。根据外界溶液与细胞内液相比的渗透压高低，可以分为三种情况：

• 低渗溶液（外面比细胞里稀，如纯水）：水大量进入细胞，动物细胞涨大，最终可能涨破（红细胞涨破叫溶血）。
• 等渗溶液（内外渗透压相当，如 0.9% 生理盐水、PBS 缓冲液、细胞培养基）：水进出平衡，细胞保持正常形态。
• 高渗溶液（外面比细胞里浓）：水从细胞流出，动物细胞皱缩。

有细胞壁的细胞（细菌、植物、酵母）情况不同：在低渗溶液里，细胞壁撑住了，细胞只会变得"鼓鼓的"而不会涨破；在高渗溶液里，细胞膜连同细胞质会与细胞壁分开，叫质壁分离。腌咸菜、用糖渍水果能防腐，正是因为高渗环境让微生物失水。

大分子怎么进细胞：转染试剂、电穿孔、病毒载体和 LNP

质粒 DNA 和 mRNA 有两个"先天缺陷"：一是体积巨大，二是骨架上每个核苷酸都带一个负电荷，整个分子带大量负电、非常亲水。它们既溶不进膜中间的疏水层，膜上也没有现成的通道或载体能运送它们，而细胞膜表面本身也略带负电，会排斥它们。所以，把基因送进细胞必须借助外力，这一类操作统称为转染（transfection）（对细菌则叫转化）。主要方法有四类：

还有两点值得记住：第一，DNA 要进细胞核才能被转录，而 mRNA 只需到达细胞质就能被翻译，所以 mRNA 起效更快；正在分裂的细胞核膜会暂时解体，质粒更容易进入细胞核，因此状态好、分裂旺盛的细胞转染效率更高。第二，质粒转染后通常不会整合进染色体，随着细胞分裂被逐渐稀释，表达只持续几天，叫瞬时转染；如果用药物筛选出把基因整合进染色体的细胞，就能得到长期稳定表达的稳定细胞株，CHO 生产抗体用的就是稳定细胞株（第 16 节）。

09细胞的能量：ATP、呼吸作用与发酵

细胞做的每件事都要花能量。这些能量从哪里来、用什么"货币"结算？

ATP：细胞的"能量货币"

ATP（三磷酸腺苷，adenosine triphosphate）由一个腺嘌呤、一个核糖和三个磷酸基团连成。最末端的磷酸键断开时，ATP 变成 ADP（二磷酸腺苷）和一个磷酸，同时释放出能被细胞直接利用的能量；细胞再利用分解食物得到的能量，把 ADP 和磷酸重新"充电"成 ATP。

可以把 ATP 想成一块可反复充电的电池：葡萄糖、脂肪像存在银行里的大额存款，不能直接花；细胞先把它们"兑换"成 ATP 这种零钱，再用来支付各种开销，包括主动运输（如钠钾泵）、合成蛋白质和 DNA、肌肉收缩、囊泡运输、细胞分裂等。ATP 不长期储存，而是随用随造、高速周转：一个成年人每天周转的 ATP 总量大约与自身体重相当。

有氧呼吸：三个阶段

有氧条件下，细胞把葡萄糖彻底分解成二氧化碳和水，释放的能量用来合成 ATP，这叫有氧呼吸（细胞呼吸）。总的结果可以写成：葡萄糖 + 氧气 → 二氧化碳 + 水 + 能量（ATP）。它不是一步"燃烧"完成的，而是分三个阶段、几十步反应逐步释放能量：

1. 糖酵解：在细胞质基质中进行，不需要氧气。一个葡萄糖（6 个碳）被拆成两个丙酮酸（各 3 个碳），净得 2 个 ATP，同时产生少量携带高能电子的 NADH。这一步所有细胞都会，从细菌到人都一样，是最古老的产能方式。
2. 三羧酸循环（又叫柠檬酸循环、克雷布斯循环）：有氧时，丙酮酸进入线粒体基质，被一步步彻底拆解，碳原子以 CO₂ 的形式释放（我们呼出的二氧化碳就来自这里），能量则大部分装进 NADH 等"充电宝"分子里，直接产生的 ATP 只有 2 个。
3. 氧化磷酸化：在线粒体内膜上进行。NADH 把高能电子交给内膜上的一串蛋白（电子传递链），电子一路传递，最后交给氧气，氧气接收电子和氢离子生成水。电子传递释放的能量被用来把氢离子泵到内膜外侧，形成浓度差；氢离子再顺浓度差流回时，驱动 ATP 合酶像水车一样转动，合成大量 ATP。有氧呼吸的绝大部分 ATP 都来自这一步。

这也解释了我们为什么需要呼吸氧气：氧气是电子传递链末端的"最终接收者"。没有氧气，电子传递链就会堵塞，第二、三阶段都停摆。

无氧时：发酵与乳酸

没有足够氧气时，细胞只能靠糖酵解获得那 2 个 ATP。但糖酵解要持续进行，必须把用掉的"空载体"（NAD⁺）回收再利用，于是细胞把丙酮酸就地转化成别的产物，这个过程叫发酵（fermentation），也叫无氧呼吸：

• 乳酸发酵：动物细胞（如剧烈运动时的肌肉）和乳酸菌把丙酮酸变成乳酸。酸奶就是乳酸菌发酵的产物。
• 酒精发酵：酵母把丙酮酸变成乙醇和二氧化碳。酿酒利用的是乙醇，面包发起来利用的是二氧化碳。

发酵产能效率很低（每个葡萄糖只得 2 个 ATP，有氧呼吸约 30 个），所以细胞要消耗多得多的葡萄糖才能获得同样的能量。有意思的是，很多快速增殖的细胞，比如癌细胞和培养中的 CHO 细胞，即使氧气充足也会把相当一部分葡萄糖转化成乳酸，这种现象叫"有氧糖酵解"（瓦博格效应）。

一句话对比：光合作用

植物和藻类的叶绿体能进行光合作用：利用光能，把二氧化碳和水合成葡萄糖，并释放氧气。从总的方程式看，光合作用和有氧呼吸正好方向相反：前者把光能储存进葡萄糖，后者把葡萄糖里的能量释放出来变成 ATP。植物细胞两样都做，动物细胞只做呼吸。

10细胞通讯：信号怎样从细胞外传到细胞内

理解了信号转导，就能理解为什么那么多抗体药都瞄准细胞表面的受体。

多细胞生物里的几十万亿个细胞必须协调行动：什么时候分裂、什么时候分化、什么时候分泌、什么时候死亡。它们靠化学信号互相"说话"。负责传话的分子统称为配体（ligand）或信号分子，包括激素（如胰岛素）、生长因子（如表皮生长因子 EGF）、细胞因子（如白细胞介素、干扰素，M6 详讲）和神经递质等。信号可以经血液传到远处的细胞（如激素），也可以只作用于邻近细胞，甚至只在两个细胞直接接触时通过膜表面的分子传递。

信号转导的四个步骤

1. 识别：配体与靶细胞上的受体（receptor）结合。受体与配体的匹配像钥匙和锁一样专一：只有带相应受体的细胞才会对这个信号有反应。
2. 转导：配体结合后，受体的形状发生改变，把信号传给细胞内的一系列分子，像接力赛一样层层传递。常见的传递方式是一个酶给下一个蛋白挂上磷酸基团（磷酸化），把它"激活"，再由它去激活下一个；也有一些小分子（如 cAMP、钙离子）充当"第二信使"在细胞内扩散。
3. 放大：传递过程中每一级都能激活多个下游分子，所以一个配体分子就能引发成千上万个分子的变化。
4. 响应：最终改变细胞的行为，例如开启或关闭某些基因、改变代谢、开始分裂、移动，甚至启动凋亡。信号用完后还会被及时关闭，否则细胞会"停不下来"（很多癌症就是生长信号通路一直处在"开"的状态）。

受体在哪里？

• 细胞膜表面受体：大多数配体是亲水的或体积大的分子（蛋白质类激素、生长因子、细胞因子），穿不过细胞膜，只能结合在膜表面的受体上。重要的家族包括：G 蛋白偶联受体（GPCR，最大的受体家族，大约三分之一的上市药物以它为靶点）、受体酪氨酸激酶（如 EGFR、HER2、胰岛素受体）、以及配体门控的离子通道。
• 细胞内受体：少数小而脂溶的信号分子（如雌激素、皮质醇等类固醇激素）能直接扩散穿过细胞膜，与细胞质或细胞核里的受体结合，直接调控基因表达。

为什么膜受体是抗体药最常见的靶点？

抗体是一个约 150 kDa、长约 10–15 nm 的大蛋白，无法穿过细胞膜进入完整的活细胞。所以抗体药只能作用于细胞外的东西：一类是血液和组织液里游离的分子（如某些细胞因子），另一类就是膜蛋白伸出细胞外的部分。膜表面受体恰好满足两个条件：它位于细胞外、抗体够得着；它控制着细胞的关键行为，阻断或激活它就能改变疾病进程。两个教科书例子（概念层面）：

相比之下，能穿过细胞膜的小分子药物可以作用于细胞内的靶点（例如细胞内的激酶）。"靶点在细胞外还是细胞内"，是决定用抗体还是小分子的重要因素之一。

11一个抗体的诞生：分泌途径

把前面的细胞器串起来。这条"分泌途径"正是 CHO 细胞生产抗体药的过程。

细胞合成的蛋白质，去向大致分两类：留在细胞质里自己用的，由游离核糖体合成，合成完就地上岗；要送出细胞（分泌蛋白）、装到细胞膜上（膜蛋白）或送进溶酶体的，则要走一条专门的路线，叫分泌途径（secretory pathway）：核糖体 → 粗面内质网 → 高尔基体 → 分泌囊泡 → 细胞膜（胞吐）。抗体、细胞因子、胰岛素、血液里的白蛋白，都是走这条路出来的。

第一步：信号肽决定"去内质网"

所有蛋白都在细胞质中的核糖体上开始合成。分泌蛋白的特别之处在于，它的最前端（N 端）有一小段约 15–30 个氨基酸、富含疏水氨基酸的序列，叫信号肽（signal peptide）。它就像快递单上的"寄往内质网"标签：

1. 信号肽一从核糖体里"冒头"，就被细胞质中一种叫信号识别颗粒的复合物认出，翻译暂时放慢；
2. 信号识别颗粒把整个核糖体带到内质网膜上，对接到膜上的一个蛋白通道；
3. 核糖体继续合成，新生的蛋白链一边合成一边穿过通道进入内质网内腔（这叫"共翻译转运"）；
4. 信号肽完成使命后被一种酶切掉，所以成熟的分泌蛋白里没有信号肽。

第二步：内质网里的折叠、组装与糖基化

进入内质网的蛋白链只是一条"线"，要折叠成正确的三维形状才有功能。内质网里有多种帮手：

• 分子伴侣：一类帮助其他蛋白正确折叠、防止它们乱成一团的蛋白；
• 二硫键：内质网的化学环境有利于蛋白中半胱氨酸之间形成二硫键，像"订书钉"一样固定结构。抗体分子里有十几对二硫键，重链与轻链之间也靠二硫键连接；
• 组装：两条重链和两条轻链在这里组装成 Y 字形的完整抗体；
• 糖基化起始：一棵预先组装好的糖链"树"被整块挂到蛋白特定的天冬酰胺上（N-糖基化）；
• 质量检查：折叠不好的蛋白会被扣留、再给机会，实在折不好就被送出内质网降解。如果蛋白生产量太大、内质网"忙不过来"，细胞会启动应激反应，减少合成，严重时甚至凋亡。这是高表达细胞株面临的一个瓶颈。

第三步：高尔基体精加工，囊泡送出细胞

通过质检的蛋白被包进囊泡运到高尔基体。在这里，糖链被进一步修剪、添加不同的糖（比如半乳糖、唾液酸、岩藻糖），最终形成成熟的"糖型"；有些蛋白还会在高尔基体里加上另一类连接在丝氨酸或苏氨酸上的糖链（O-糖基化）。然后高尔基体按照"地址标签"分拣：分泌蛋白装进分泌囊泡，移动到细胞膜，通过胞吐释放到细胞外。

为什么细菌做不了糖基化？为什么抗体要用哺乳动物细胞？

糖基化（glycosylation）就是在蛋白上连接糖链的修饰，主要在内质网开始、在高尔基体完成。它不是装饰：糖链影响蛋白的折叠、稳定性、溶解性、在血液中的半衰期，以及抗体能否有效招募免疫细胞。例如抗体 Fc 区有一个保守的糖基化位点，糖型的细微差别（比如有没有岩藻糖）就会明显改变它杀伤靶细胞的能力。

大肠杆菌是原核细胞，没有内质网和高尔基体，也没有真核式的糖基化酶系统，所以表达出来的蛋白不带这些糖链；它的细胞质环境还不利于二硫键形成，复杂的多链蛋白很难正确折叠组装。酵母和昆虫细胞虽然有内质网和高尔基体，但糖链的类型与人不同（酵母倾向于挂上大量甘露糖，昆虫细胞的糖链较简单）。CHO 等哺乳动物细胞的分泌途径与人最接近，能正确折叠和组装 Y 字形抗体，加上与人相近的糖型，所以完整的抗体药几乎都用哺乳动物细胞生产。反过来，不需要糖基化的小型抗体片段（如单链抗体、纳米抗体、部分 Fab）则可以用大肠杆菌或酵母生产，更快更便宜。

12细胞周期与细胞分裂：一个变两个

分裂是生长、修复和繁殖的基础；分裂失控，就是癌症。

一个受精卵要发育成几十万亿个细胞的人，皮肤、肠道和血液里的细胞每天都要更新，伤口愈合需要新细胞补位，这些都靠细胞分裂。真核细胞的分裂比细菌的二分裂复杂得多，因为它有多条线状染色体，必须保证每条染色体都被精确复制、再平均分到两个子细胞里，一条都不能多、一条都不能少。

先认识染色体

人的体细胞有 46 条染色体，组成 23 对。每一对里的两条大小、形状相同，携带同样位置的基因，一条来自父亲、一条来自母亲，叫同源染色体。含有两套染色体的细胞叫二倍体（体细胞都是），只有一套的叫单倍体（精子和卵子）。平时 DNA 以松散的染色质形式存在；DNA 复制后，每条染色体由两条完全相同的姐妹染色单体组成，它们在一个叫着丝粒的位置连在一起，分裂时凝缩成显微镜下可见的"X"形。

细胞周期：G1、S、G2、M

真核细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束，叫一个细胞周期（cell cycle）。它分为间期（G1、S、G2 三个阶段）和分裂期（M 期）。间期看起来"什么都没发生"，其实细胞在忙着长大和复制 DNA，占了整个周期的绝大部分时间；M 期只占一小段。典型的人体细胞完成一个周期大约需要 24 小时；用于生产的 CHO 细胞通常需要十几到二十几小时。

还有很多细胞会暂时或永久地退出细胞周期，进入一种"休眠"状态，叫 G0 期。例如成熟的神经细胞、心肌细胞基本不再分裂；肝细胞平时处于 G0，肝脏受损时又能重新进入周期。

检查点：细胞周期的"质检关卡"

为了保证分裂不出错，细胞周期里设有几道检查点（checkpoint），条件不满足就暂停：

• G1/S 检查点：细胞够大吗？营养够吗？有没有收到"可以分裂"的生长因子信号？DNA 有没有损伤？通过了才进入 S 期复制 DNA。这是最关键的一道关卡。
• G2/M 检查点：DNA 是否已经完整复制、没有损伤？通过了才进入分裂期。
• 纺锤体检查点（M 期中）：是不是每条染色体都已经被纺锤丝正确拉住？全部就位才允许姐妹染色单体分开。

推动细胞周期前进的"引擎"是一类叫周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶（CDK）的蛋白，它们像定时开关一样依次启动各个阶段。一种叫 p53 的蛋白被称为"基因组守护者"：发现 DNA 损伤时，它让细胞周期停下来修复；损伤太严重修不好，就启动细胞凋亡（第 14 节）。

有丝分裂：前期、中期、后期、末期

有丝分裂（mitosis）是真核细胞把复制好的染色体平均分配给两个子细胞的过程，名字来自显微镜下看到的纺锤"丝"。它是一个连续的过程，为了便于描述，人为分成四个时期，之后是胞质分裂。点击下面的分步动画，看一个含 4 条染色体（2 对同源染色体）的示意细胞如何分裂：

三种分裂方式对照

减数分裂：为有性生殖准备配子

如果精子和卵子都有 46 条染色体，受精卵就会有 92 条，每代翻倍显然不行。所以生殖器官里的细胞要通过一种特殊的分裂产生配子（精子和卵子），这就是减数分裂（meiosis）。它的要点是"复制一次、连续分裂两次"：

• 减数第一次分裂：同源染色体先两两配对，配对时相互交换片段（叫交叉互换，产生父母基因的新组合），然后同源染色体分开，分别进入两个细胞，染色体数目在这一步减半。
• 减数第二次分裂：类似一次有丝分裂，姐妹染色单体分开。

最终一个细胞产生 4 个单倍体细胞，每个只有 23 条染色体，而且由于交叉互换和同源染色体随机分配，每个配子的基因组合都不相同。这正是 M3 等模块讲到的遗传规律的细胞学基础：一对等位基因分别位于一对同源染色体上，减数分裂时随同源染色体分离而分开，所以每个配子只得到其中一个。如果某对染色体在减数分裂时没有正常分开，就会产生染色体数目异常的配子，例如多一条 21 号染色体会导致唐氏综合征。

癌症：细胞周期失控

正常细胞的分裂受到严格控制：没有生长因子信号不分裂，DNA 受损要停下来修复，细胞长满、彼此接触时就停止分裂（接触抑制），分裂一定次数后就衰老。癌症的本质，是一个细胞积累了多个基因突变，逐步摆脱了这些控制，变得无限、无序地增殖，最终侵入周围组织、转移到身体其他部位。参与的基因主要有两类：

• 原癌基因：正常时负责"踩油门"促进分裂（如编码生长因子受体的基因）。突变或拷贝数异常增多后，油门被"卡死"，一直发出分裂信号。HER2 基因扩增就是例子。
• 抑癌基因：正常时负责"踩刹车"或启动凋亡（如 p53）。两份拷贝都失活后，刹车失灵，受损细胞也不再被清除。

癌细胞还会逃避凋亡、维持端粒长度从而无限分裂、诱导血管生成为自己供血、躲避免疫系统的攻击。相应地，抗癌药物也有多种思路：传统化疗药攻击正在分裂的细胞（损伤 DNA 或干扰微管，因此也会伤害毛囊、肠道等分裂快的正常细胞）；靶向药精准抑制失控的信号（如 HER2 抗体）；免疫治疗则重新激活免疫细胞去清除癌细胞（如抗 PD-1 抗体、CAR-T）。

13细胞分化与干细胞：同一套基因，两百多种细胞

为 M7 的细胞治疗打基础：干细胞是什么，iPSC 为什么重要。

人体由 200 多种细胞构成：神经细胞细长、能传导电信号；红细胞小而扁、装满血红蛋白；肌肉细胞能收缩；浆细胞专门分泌抗体。然而它们都来自同一个受精卵，细胞核里的 DNA 基本相同。差别从哪里来？答案是细胞分化（cell differentiation）：细胞在发育过程中选择性地表达不同的基因，从而在形态、结构和功能上变得各不相同。好比同一本菜谱，川菜馆只翻川菜那几页，粤菜馆只翻粤菜那几页（基因表达调控在 M3 讲）。分化通常是稳定的，一个成熟的肝细胞不会自己变成神经细胞。

干细胞：既能"复制自己"，又能"变成别人"

干细胞（stem cell）是一类尚未完全分化的细胞，具有两个核心能力：自我更新（分裂产生和自己一样的干细胞，保持"库存"）和分化潜能（在合适条件下分化成特定类型的细胞）。按分化潜能的大小，可以分成几个等级：

胚胎干细胞与 iPSC

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）取自早期胚胎（受精后约 5–7 天的囊胚）内部的一团细胞，1998 年首次在人类中建立。它分化潜能强，但获取时需要破坏胚胎，因此长期伴随伦理争议，而且用于移植时存在免疫排斥问题。

2006 年，日本科学家山中伸弥发现：只要把 4 个特定的基因（编码 4 种转录因子）导入已经分化的皮肤细胞，就能把它"重新编程"回类似胚胎干细胞的多能状态，这种细胞叫诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），他因此获得 2012 年诺贝尔生理学或医学奖。iPSC 的意义在于：

• 不需要胚胎，绕开了主要的伦理争议；
• 可以来自患者本人，理论上分化出的细胞移植回去不会被排斥；
• 可以无限扩增，再定向分化成神经细胞、心肌细胞、免疫细胞等，用于疾病建模、药物筛选和细胞治疗。

挑战也很明显：重编程和定向分化的效率与一致性有待提高；残留的未分化细胞有形成肿瘤的风险，安全性需要严格评估。

14细胞死亡：凋亡与坏死

细胞也有"体面退场"和"意外身亡"之分，这直接关系到细胞培养中的活率。

细胞死亡并不总是坏事。人体每天有大量细胞按计划死去，再由新细胞补上。生物学上最重要的两种细胞死亡方式是凋亡和坏死：

细胞凋亡：程序性的"自我拆除"

细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制、按程序进行的主动死亡，常被称为"细胞自杀"。触发它的可能是细胞内部的问题（如 DNA 严重损伤、内质网压力过大，线粒体释放信号分子），也可能是外部的"死亡信号"（如免疫细胞发出的指令）。启动后，一类叫半胱天冬酶（caspase）的蛋白酶被依次激活，有条不紊地拆解细胞：细胞皱缩，染色质凝聚，DNA 被切成片段，细胞膜鼓出小泡，最后整个细胞分割成一个个被膜包裹的"凋亡小体"，被周围的吞噬细胞吃掉。因为细胞内容物始终包在膜里、不外泄，凋亡不引起炎症。

凋亡的生理作用很多：胚胎发育时，手指之间的蹼就是靠凋亡去除的；免疫系统靠凋亡清除会攻击自身的免疫细胞；被病毒感染或 DNA 受损的细胞也会被凋亡清除，防止癌变。癌细胞的一个特征正是"逃避凋亡"。

细胞坏死：被动的"意外死亡"

细胞坏死（necrosis）是细胞受到严重损伤（如缺氧、缺营养、高温、毒素、物理损伤、剧烈的渗透压变化）后被动死亡。坏死的细胞先肿胀，细胞器损坏，最后细胞膜破裂，内容物泄漏到周围，引发炎症。

联系细胞活率：怎么分辨死细胞

在细胞培养中，细胞活率（viability）指活细胞占细胞总数的百分比，是判断细胞状态最常用的指标。最经典的检测方法是台盼蓝（trypan blue）染色：台盼蓝是一种蓝色染料，活细胞膜完整，能把它挡在外面，在显微镜下透亮不着色；死细胞膜已经破损，染料进入，细胞被染成蓝色。数一数蓝色和不着色的细胞，就能算出活率：活率 = 未着色细胞数 ÷ 细胞总数 × 100%。

注意一个细节：早期凋亡的细胞膜仍然完整，台盼蓝会把它算作"活细胞"。要检测早期凋亡，可以用流式细胞术配合专门的荧光染料（例如能识别凋亡细胞膜表面变化的 Annexin V，加上只进入膜破损细胞的 PI 染料），把活细胞、早期凋亡和晚期凋亡或坏死的细胞区分开。

15细胞培养基础：在体外养好细胞

工作中最常听到的细胞术语，几乎都在这一节：传代、贴壁、悬浮、支原体、活率、冻存、细胞库、对数期。

细胞培养（cell culture）是把细胞从生物体中取出（或从细胞库中复苏），放在人工控制的环境里让它们存活和增殖。几乎所有的生物药生产（抗体、重组蛋白、病毒载体）和大部分细胞实验都建立在细胞培养之上。要养好细胞，就要在体外尽量模拟体内的环境：合适的温度、pH、渗透压、营养，以及不被微生物污染。

原代细胞与细胞系

原代细胞（primary cells）是直接从组织或血液中分离出来的细胞，例如从献血者血液中分离的 T 细胞、从皮肤组织中分离的成纤维细胞。它们最接近体内的真实状态，但在体外只能分裂有限的次数（人的正常细胞通常只能分裂约 50 次左右，之后就衰老停止分裂，这叫海弗利克极限，与染色体末端的端粒逐渐缩短有关），而且不同供者之间差异较大。

细胞系（cell line）则是获得了无限增殖能力、可以长期传代培养的细胞群体，是实验和生产的标准化"原材料"。细胞系的来源有几种：取自肿瘤组织、经病毒基因转化、或在长期培养中自发获得永生能力。工作中最常见的三个：

• HeLa：1951 年取自宫颈癌患者 Henrietta Lacks 的肿瘤组织，是第一个人类永生化细胞系。
• CHO（中国仓鼠卵巢细胞）：1950 年代从中国仓鼠的卵巢细胞建立，容易培养、能适应悬浮生长和无血清培养，成为生物药行业的主力生产细胞。
• HEK293（人胚肾 293 细胞）：1970 年代由人胚肾细胞经腺病毒 DNA 转化获得，转染效率高，常用于瞬时表达和病毒载体生产。

贴壁细胞与悬浮细胞

• 贴壁细胞：必须附着在表面上才能生长，例如 HeLa、成纤维细胞和大多数原代组织细胞。它们在经过特殊处理的塑料培养瓶、培养皿或多孔板底部铺展成一层（单层），长满后会因接触抑制而停止分裂。传代时需要用胰蛋白酶（一种蛋白酶）把细胞从瓶底"消化"下来。贴壁培养扩大规模只能增加表面积，比较麻烦。
• 悬浮细胞：在培养液中自由漂浮生长，例如血液中的淋巴细胞，以及经过驯化的 CHO 和 HEK293 生产细胞株。悬浮细胞可以在摇瓶里培养，也可以放大到几百升乃至上万升的生物反应器中搅拌培养，非常适合工业化生产。这就是为什么生产用的 CHO 几乎都是悬浮培养。

培养基：细胞的"饭菜"

培养基（culture medium）是为细胞提供营养和合适化学环境的液体。哺乳动物细胞培养基的主要成分如下：

血清好用，但问题也不少：成分不明确、批次之间差异大、价格高，还可能带入动物来源的病毒等污染物。所以用于药物生产的细胞通常被驯化成在无血清培养基甚至化学成分限定培养基（每种成分和浓度都明确）中生长，这样工艺更稳定、监管风险更低。

培养条件：37 °C 和 5% CO₂

哺乳动物细胞放在 CO₂ 培养箱里培养，标准条件是：

• 37 °C：模拟人体体温（昆虫细胞则在约 27–28 °C 培养）。
• 5% CO₂：这不是给细胞"呼吸"的，而是为了配合培养基里的碳酸氢钠缓冲体系。CO₂ 溶于水形成碳酸，与碳酸氢根达成平衡，把培养基的 pH 稳定在约 7.2–7.4。如果把培养瓶长时间拿出培养箱，CO₂ 逸出，培养基会逐渐变碱、颜色变紫红。
• 高湿度（约 95%）：防止培养基蒸发，避免渗透压升高。

大规模生物反应器则通过传感器实时监控并自动调节温度、pH、溶解氧和搅拌速度。

传代：给细胞"分家"

细胞在一个培养瓶里不断增殖，迟早会长满（贴壁细胞铺满瓶底）或密度过高（悬浮细胞），营养耗尽、废物积累。这时要把细胞取出一部分，用新鲜培养基稀释到新的培养瓶中继续培养，这叫传代（passage）。贴壁细胞通常在长到约 70%–90% 满时传代，先用胰蛋白酶消化下来；悬浮细胞直接按比例稀释即可。每传一次，传代数（常写作 P1、P2……）加 1。细胞传代次数太多可能发生遗传和性状的漂移，所以实验和生产都倾向于使用传代数较低的细胞。

无菌操作与污染

培养基营养丰富、温度适宜，对微生物来说也是天堂。细菌分裂比哺乳动物细胞快几十倍，一旦混入很快就会"喧宾夺主"。所以细胞操作必须在生物安全柜（通过高效过滤器送出无菌气流的操作台）中进行，台面和物品用 70%–75% 酒精擦拭，使用无菌的耗材，避免说话、避免手跨越敞开的瓶口，不同细胞系分开操作。常见污染类型：

支原体（mycoplasma）特别值得一提：它是已知最小的能独立生活的细菌，直径只有约 0.2–0.3 μm，接近光学显微镜的分辨极限；更关键的是它没有细胞壁（第 04 节讲过的肽聚糖），所以作用于细胞壁的青霉素类抗生素对它完全无效，它还能变形挤过常规的除菌滤膜。支原体污染不会让培养液变浑，却会悄悄改变细胞的代谢、生长和基因表达，让实验数据失真。因此正规的细胞库、实验室和生产细胞都要定期做支原体检测，"支原体阴性"是交付细胞时的常见质量要求。

细胞计数与活率

传代、接种、转染、冻存之前，都要先知道"有多少细胞、有多少是活的"。传统方法是用血球计数板：把混有台盼蓝的细胞悬液滴入刻有方格的玻璃板，在显微镜下数一定体积里的活细胞（不着色）和死细胞（蓝色），换算出活细胞密度（每毫升多少个活细胞）和活率（第 14 节）。现在多用自动细胞计数仪，原理相同。状态良好的细胞活率通常在 90% 以上；工业化的 CHO 补料培养中，活细胞密度可以达到每毫升千万个以上。

冻存与复苏：慢冻快融

细胞不能一直传代下去，暂时不用的细胞要冻存起来。难点在于：细胞里大部分是水，直接冷冻会形成冰晶，像小刀一样刺破细胞膜和细胞器。解决办法是：

• 在冻存液中加入冷冻保护剂，最常用的是约 10% 的二甲基亚砜（DMSO），它能进入细胞，减少冰晶形成（细菌菌种则常用甘油保存）；
• 缓慢降温（大约每分钟降低 1 °C，常用程序降温盒），让水分有时间渗出细胞；
• 最后转入液氮（约 −196 °C）中长期保存，在这样的低温下细胞的代谢几乎完全停止，可以保存很多年。

复苏时则要快速融化：把冻存管放进 37 °C 水浴中迅速解冻（避免缓慢升温时冰晶重新长大），然后尽快把细胞转入大量新鲜培养基中，或离心去掉含 DMSO 的冻存液，因为 DMSO 在常温下对细胞有毒性。这个原则常被总结为"慢冻快融"。

细胞库：保证几十年如一日

一个抗体药可能要生产几十年，每一批都必须来自"同一个"细胞。为此，生物药企业建立了两级细胞库（cell bank）：

1. 从筛选出的最优单克隆细胞株扩增，一次性冻存几百支，叫主细胞库（MCB）；
2. 从一支 MCB 复苏扩增，再冻存一批，叫工作细胞库（WCB）；
3. 每次生产，都从一支 WCB 开始扩增。WCB 用完了，再从 MCB 取一支重新建立。

这样，所有批次都追溯到同一个源头，而且传代数可控。细胞库在使用前要经过全面检测，包括无菌、支原体、外源病毒和细胞身份鉴定等。研究用的细胞也有类似做法：收到细胞后先扩增冻存一批"种子"，日常实验用的细胞传代过多就丢弃，再复苏一支新的。

微生物生长曲线：四个阶段

把少量细菌接种到一瓶新鲜培养液中（不中途补料），定时测量活菌数量，以时间为横轴、活菌数的对数为纵轴作图，会得到一条典型的生长曲线（growth curve），分为四个阶段：

1. 延迟期（lag phase）：细菌刚到新环境，需要调整代谢、合成相应的酶，数量几乎不增加。接种的细菌状态越好、新旧培养基越相似，延迟期越短。
2. 对数期（log phase，又称指数期）：细菌以恒定的速度分裂，每过一个倍增时间数量就翻一番，数量呈指数增长。这一阶段的细胞代谢最旺盛、形态和生理状态最一致，所以制备感受态细胞、诱导蛋白表达（例如在对数中期加入诱导剂）都选在这个阶段。
3. 稳定期（stationary phase）：营养逐渐耗尽、代谢废物积累、pH 改变，分裂速度下降，新生的细胞数与死亡的细胞数大致相等，总数不再增加。培养过夜用于提取质粒的菌液，通常处在对数期末到稳定期初。
4. 衰亡期（death phase）：环境继续恶化，死亡速度超过分裂速度，活细胞数量下降，细胞可能裂解。

实验室常用分光光度计测量菌液在 600 nm 波长下的光密度（OD600）来估计细菌浓度：菌越多，液体越浑浊，OD600 越高。哺乳动物细胞的一次性批次培养也有类似的曲线。工业生产中常用补料分批培养：在培养过程中不断补加浓缩营养，推迟稳定期和衰亡期，尽量延长细胞高活率、高产的时间。

倍增时间：为什么细菌这么"快"

对数期细胞数量翻一番所需的时间叫倍增时间（doubling time）。细胞数量可以用一个简单的式子估算：细胞数 = 起始细胞数 × 2ⁿ，n 是经历的倍增次数（培养时间 ÷ 倍增时间）。例如大肠杆菌每 20 分钟翻一倍，7 小时就是 21 次倍增，1 个细菌理论上能变成 2²¹，约 200 万个；而倍增时间约 20 小时的 CHO 细胞，7 小时还没分裂一次。不同细胞的倍增时间差别很大：

倍增时间受培养基、温度、细胞株和培养方式影响很大，表中只是数量级上的参考。

16联系工作：实验室里的五种"细胞工厂"

客户咨询蛋白表达、抗体生产、病毒载体时，第一个问题往往是"用什么宿主"。

把一个基因放进细胞、让细胞替我们生产对应的蛋白，叫重组表达，承担生产任务的细胞叫表达宿主。前面各节的知识在这里汇合：宿主是原核还是真核（第 03 节），有没有内质网和高尔基体、能不能糖基化（第 11 节），会不会带来内毒素（第 04 节），长得快不快（第 15 节），能不能悬浮放大培养（第 15 节）。没有"最好"的宿主，只有"最合适"的宿主。

大肠杆菌：又快又便宜的"原核工厂"

优点：繁殖极快（约 20 分钟一代），培养基便宜，遗传背景清楚，转化操作简单，简单蛋白的产量可以很高，从拿到质粒到得到蛋白往往只需几天。最常用的表达系统（如 pET 系统）利用强启动子在诱导后大量表达目标蛋白（M4 详讲）。

局限：作为原核细胞，它没有内质网和高尔基体，不能做真核式糖基化；细胞质环境不利于二硫键形成；大而复杂的真核蛋白常常折叠错误，聚集成不溶的颗粒，叫包涵体（inclusion body），需要先变性溶解、再体外复性，费时且不一定成功（降低诱导温度、加融合标签等方法有时能改善可溶性，但提高温度、延长培养通常适得其反）；它是革兰氏阴性菌，产物需要去内毒素；表达的蛋白一般留在细胞内，需要裂解细胞再纯化。

适合：质粒 DNA 生产（质粒本来就是在细菌里复制的）；不需要糖基化的较简单蛋白，如很多工具酶（限制性内切酶、DNA 聚合酶）、抗原片段、不带糖链的抗体片段（单链抗体、纳米抗体、部分 Fab）；历史上第一个重组蛋白药物人胰岛素也是用大肠杆菌生产的。

酵母：会分泌的"真核单细胞工厂"

常用的有酿酒酵母和毕赤酵母。优点：它是真核细胞，拥有内质网和高尔基体，能把蛋白分泌到培养液中、形成二硫键，复杂蛋白折叠得比大肠杆菌好；同时它像微生物一样长得快、能在廉价培养基中达到很高的密度，而且不产生内毒素。毕赤酵母尤其擅长高密度发酵和高水平分泌表达。

局限：酵母会给蛋白挂上大量甘露糖组成的糖链（"高甘露糖型"），与人的糖型差别明显，可能影响药效、引起免疫反应或缩短药物在体内的时间，所以一般不用来生产需要人源糖型的全长抗体。

适合：工业酶、部分重组蛋白药物（如胰岛素也有用酵母生产的）、乙肝疫苗等疫苗抗原、纳米抗体等。

昆虫细胞 + 杆状病毒：复杂蛋白的"中间选项"

最常用的是 Sf9 等来源于草地贪夜蛾卵巢的细胞，配合杆状病毒表达系统（BEVS）使用：先把目标基因放进一种只感染昆虫、不感染哺乳动物的杆状病毒基因组中，得到重组病毒，再用它感染昆虫细胞；病毒在细胞里利用很强的启动子大量表达目标蛋白。

优点：真核细胞，折叠和修饰能力比微生物强得多，擅长表达大型、多结构域的蛋白（如各种激酶）和需要多个亚基组装的蛋白复合物，常用于结构生物学研究；对人安全；还能生产病毒样颗粒（VLP）疫苗和用于基因治疗的 AAV。昆虫细胞在约 27 °C 培养，不需要 CO₂。

局限：糖链比哺乳动物简单（通常缺少人蛋白上常见的末端唾液酸），需要先构建重组病毒，周期比大肠杆菌长。

CHO：抗体药的"主力工厂"

为什么是 CHO：①它是哺乳动物细胞，分泌途径与人接近，能正确折叠、组装 Y 字形抗体，并加上与人相近的糖型；②经过几十年驯化，它能在无血清培养基中悬浮生长，适合放大到上万升的生物反应器，产量可达每升数克；③很多感染人的病毒不容易在 CHO 中复制，安全性较好；④监管机构对 CHO 生产的药物积累了大量经验，审批路径成熟。所以大多数上市的单克隆抗体和许多其他重组蛋白药物都用 CHO 生产。

局限：生长慢、培养基贵、工艺复杂；要获得高产的稳定细胞株（目标基因整合进染色体，第 08 节），需要经过转染、加压筛选、单克隆挑选和长期稳定性评估，通常要数月；糖型与人接近但不完全相同，生产中需要检测和控制。

HEK293：人源细胞，转染快、能"代工"病毒

优点：人源细胞，蛋白修饰最接近人；非常容易转染，用 PEI 等试剂把质粒送进去后几天到一两周就能收获蛋白，因此常用来瞬时表达，快速生产少量到中等量的抗体和蛋白用于筛选和研究；它在建立时导入了腺病毒的部分基因，能提供病毒包装所需的一些"帮手"功能，所以是生产 AAV、慢病毒、腺病毒等病毒载体最常用的细胞（例如 293T 衍生株常用于慢病毒生产）。

局限：作为人源细胞，理论上更容易被感染人的病毒污染；用于大规模抗体药生产时，产量和工艺成熟度通常不如 CHO。

17术语卡片：点击翻面

先看正面自己解释一遍，再翻过来核对。

18模块测验

14 道题，答完自动计分，成绩会记录在课程首页。答错的题，解析末尾有回看链接。

延伸资源

• Khan Academy 生物学：细胞结构、细胞膜与运输、细胞呼吸、细胞分裂等单元，有配套练习。
• Crash Course Biology：细胞相关章节，B 站可搜中文字幕版。
• 搜索"细胞 3D 动画""有丝分裂动画"：直观看到细胞器的立体结构与分裂过程。
• 工作练习 1：打开金斯瑞蛋白表达服务页，找出它提到的表达宿主，并用本模块的知识说明各自适合什么蛋白。
• 工作练习 2：找一份细胞培养或质粒提取的实验步骤，标出其中哪些步骤与渗透压、无菌操作、内毒素或活率有关。