本模块你将学会
这是课程中最核心的一个模块。学完后，回到这里检查自己能否做到每一条。
- 说清中心法则的五条信息流向、"基因表达"的含义，以及"信息不能从蛋白质回到核酸"的意思
- 用等位基因、显性/隐性、基因型/表型、纯合/杂合解释孟德尔的 3:1 分离比
- 读懂一个基因的结构：启动子、转录起点、UTR、起始/终止密码子、外显子与内含子、终止子
- 解释 DNA 半保留复制，以及前导链、后随链、冈崎片段为什么存在，并把它和 PCR 对应起来
- 区分模板链与编码链，说明 mRNA 加工的三个步骤和 cDNA 的用途
- 熟练查阅遗传密码表，把一段 DNA 翻译成氨基酸序列
- 描述核糖体翻译的起始、延伸、终止三个阶段，以及 SD 序列与 Kozak 序列的区别
- 判断同义、错义、无义、移码等突变类型，说出突变的来源、修复方式和 SNP 的含义
- 用乳糖操纵子解释"基因开关"和 IPTG 诱导，并说出真核调控的主要手段（转录因子、表观遗传、RNA 干扰）
- 把"密码子优化""cDNA""ORF 克隆""体外转录（IVT）""修饰核苷"等工作术语对应到具体知识点
01遗传信息的流向：中心法则
分子生物学最重要的一张"信息流程图"。
1958 年，弗朗西斯·克里克（Francis Crick，DNA 双螺旋的发现者之一）在论文《论蛋白质合成》中提出了一个大胆的推论，并称之为中心法则（Central Dogma）：遗传信息可以从核酸传递到核酸、从核酸传递到蛋白质，但一旦进入蛋白质，就再也不能传出来。
教科书上常把它简化为一句话："DNA → RNA → 蛋白质"。这条主线确实是所有细胞每时每刻都在做的事，但完整的图景还包括几条"支线"。1970 年，科学家在逆转录病毒中发现了能以 RNA 为模板合成 DNA 的逆转录酶，克里克随后发表文章重申并细化了中心法则：逆转录并不违反它，因为它强调的核心是蛋白质里的序列信息不能回流到核酸。
点击图中的每个箭头（或下方的标签），查看它的含义、发生场景和工作中的例子。
复制：DNA → DNA
是什么：以 DNA 的两条链为模板，复制出两份完全相同的 DNA。
何时发生：细胞分裂之前（真核细胞在细胞周期的 S 期）。每个子细胞都必须拿到一套完整的"设计图"。
🧬 PCR 就是在试管里模拟这一过程，第 04 节详细讲。
转录：DNA → RNA
是什么：RNA 聚合酶以 DNA 的一条链为模板，合成一条序列互补的 RNA，相当于把设计图中的一页"复印"出来。
例子：CHO 细胞核中的抗体基因被转录成 mRNA，送到细胞质去指导蛋白合成。
转录是基因表达调控最主要的关口（第 09 节）。
翻译：RNA → 蛋白质
是什么：核糖体按照 mRNA 上每三个碱基一组的"密码子"，把氨基酸逐个连接成多肽链。
这一步把 4 种碱基的"核酸语言"转换成 20 种氨基酸的"蛋白质语言"，转换规则就是遗传密码（第 06 节）。
逆转录：RNA → DNA
是什么：逆转录酶以 RNA 为模板合成 DNA。1970 年由特明（Temin）和巴尔的摩（Baltimore）各自独立发现，两人因此分享了 1975 年诺贝尔生理学或医学奖。
病毒的例子：HIV 是逆转录病毒，进入细胞后先把自己的 RNA 基因组逆转录成 DNA，再整合进宿主染色体。1987 年获批的第一个抗 HIV 药物齐多夫定（AZT）就是逆转录酶抑制剂。
🧬 实验室用途：RT-PCR 先用逆转录酶把 mRNA 变成 cDNA，再做 PCR 扩增，新冠核酸检测用的就是这一原理（RT-qPCR）。从 mRNA 制备 cDNA、构建 cDNA 文库也靠它。
RNA 复制：RNA → RNA
是什么：以 RNA 为模板直接复制 RNA，需要"依赖 RNA 的 RNA 聚合酶"。正常的人体细胞一般不进行这种复制。
例子：流感病毒、丙肝病毒、新冠病毒等 RNA 病毒依靠自己编码的这种酶复制基因组（HIV 不是，它走逆转录）。
🧬 "自扩增 mRNA"疫苗借用了这条通路：mRNA 上额外编码一套病毒来源的复制酶，进入细胞后能自我扩增。
禁行线：蛋白质 → 核酸
这才是中心法则真正的核心：迄今没有发现任何机制能把蛋白质的氨基酸序列"反向写回"DNA 或 RNA。
朊病毒（引起疯牛病的致病蛋白）能让正常蛋白改变形状，但传递的是"构象"而不是序列，因此不违背中心法则。
🧬 工作启示：要生产一个蛋白，必须先拿到编码它的 DNA。从蛋白序列倒推 DNA 时，由于一个氨基酸往往对应多个密码子，会有大量不同的写法，这正是"密码子优化"的空间（第 10 节）。
五条通路一览
上面流程图里每个箭头的要点汇总在下表中。前三条是"主线"，每个细胞都在进行；后两条是"支线"，主要出现在某些病毒和实验室里。
| 通路 | 由谁完成 | 什么时候、在哪里发生 | 工作中的例子 |
|---|---|---|---|
| 复制 DNA → DNA | DNA 聚合酶等一组酶 | 细胞分裂之前，把整套 DNA 复制一份（真核细胞在细胞核内） | PCR 就是在试管里模拟复制（第 04 节） |
| 转录 DNA → RNA | RNA 聚合酶 | 需要某个基因的产物时，把这段 DNA "抄"成 RNA | 表达载体上的启动子决定转录强弱（第 05、09 节） |
| 翻译 RNA → 蛋白质 | 核糖体（配合 tRNA） | 在细胞质中，按 mRNA 上的密码子把氨基酸连成链 | 所有重组蛋白、抗体的生产最后都靠这一步（第 07 节） |
| 逆转录 RNA → DNA | 逆转录酶 | 逆转录病毒（如 HIV）感染细胞后；实验室中用于制备 cDNA | RT-PCR、cDNA 文库、cDNA 克隆 |
| RNA 复制 RNA → RNA | 依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（多由病毒自己编码） | 流感病毒、新冠病毒等 RNA 病毒复制自己的基因组；正常人体细胞一般不做 | "自扩增 mRNA"疫苗借用了这条通路 |
| 禁行 蛋白质 → 核酸 | 不存在 | 迄今未发现任何机制能把氨基酸序列写回核酸 | 要生产一个蛋白，必须先拿到编码它的 DNA |
两条"支线"：逆转录与 RNA 复制
逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA，方向和转录正好相反，由逆转录酶（reverse transcriptase）完成。它是 1970 年由特明和巴尔的摩各自独立发现的，两人因此分享了 1975 年诺贝尔生理学或医学奖。携带逆转录酶、靠逆转录完成生命周期的 RNA 病毒叫逆转录病毒（retrovirus），最著名的是 HIV：它进入细胞后，先把自己的 RNA 基因组逆转录成 DNA，再把这段 DNA 插入宿主的染色体，从此随宿主细胞一起被复制。第一个抗 HIV 药物齐多夫定（AZT，1987 年获批）就是逆转录酶抑制剂。
实验室把逆转录酶当作工具：以细胞里的 mRNA 为模板逆转录得到的 DNA，叫互补 DNA（cDNA）。cDNA 保留了 mRNA 的信息，又像 DNA 一样稳定、可以用 PCR 扩增和克隆。新冠核酸检测用的 RT-qPCR，就是"先逆转录（RT）、再做定量 PCR"。第 05 节会讲 cDNA 为什么特别有用。
RNA 复制是以 RNA 为模板直接合成 RNA，需要一种"依赖 RNA 的 RNA 聚合酶"。正常人体细胞一般不进行这种复制，所以这条通路主要属于 RNA 病毒：流感病毒、丙肝病毒、新冠病毒都自己编码这种酶来复制基因组（注意 HIV 不走这条路，它走逆转录）。
这两条支线都没有违反中心法则，因为中心法则的核心是最后一行：信息可以在核酸之间流动，但不能从蛋白质流回核酸。朊病毒（引起疯牛病的致病蛋白）能让正常蛋白改变形状，传递的是"构象"而不是序列，因此也不违背它。
什么是"基因表达"
你会在工作中反复听到"表达"这个词。基因表达（gene expression）指的是：一个基因携带的信息被细胞读出来、合成出功能产物的过程。对编码蛋白质的基因来说，表达包括转录和翻译两步，产物是蛋白质；对 tRNA、rRNA 这类只产生 RNA 的基因来说，转录出有功能的 RNA 就算表达完成。
"表达量"就是这个过程最终产出多少产物。客户说"这个蛋白在大肠杆菌里不表达"，意思是转录、翻译或之后的某一步出了问题，最后没得到足够的蛋白；"高表达细胞株"则是能大量产出目标蛋白的细胞。本模块后面的每一节，都在讲这条流水线上的某一个环节。
为什么要绕道 RNA，而不是直接用 DNA 造蛋白？
DNA 不出档案室
真核细胞的 DNA 留在细胞核内，被反复读取的是 RNA 副本。副本损坏了可以再印，原件损坏则会传给所有后代细胞。
一份基因，海量产品
一个基因可以转录出许多条 mRNA，每条 mRNA 又能被许多核糖体反复翻译，层层放大，短时间内产出大量蛋白。
更多的"开关"
转录多少、RNA 怎么加工、保留多久、翻译多快，每一步都能调节。细菌的 mRNA 通常几分钟就被降解，基因关掉后产物能很快停止。
中心法则被"推翻"过吗？
常有人说逆转录"推翻了中心法则"，这是误解。克里克 1970 年的文章把信息传递分成三类：普遍存在的（DNA→DNA、DNA→RNA、RNA→蛋白质）；特殊情况下的（RNA→RNA、RNA→DNA，以及只在实验条件下观察到的 DNA 直接指导蛋白合成）；从未见过的（从蛋白质到任何分子）。后来的发现都没有越过第三类。
需要补充的是，"dogma"一词克里克本人后来承认用得不太恰当，它更像一个经受住了检验的假说，而不是不可质疑的教条。
本节要点
- 中心法则的主线是复制（DNA→DNA）、转录（DNA→RNA）、翻译（RNA→蛋白质），分别由 DNA 聚合酶、RNA 聚合酶和核糖体完成。
- 逆转录（RNA→DNA）由逆转录酶完成，见于 HIV 等逆转录病毒；实验室用它把 mRNA 变成 cDNA，RT-PCR 也靠它。
- RNA 复制（RNA→RNA）主要见于流感、新冠等 RNA 病毒，正常人体细胞一般不做。
- 中心法则的核心是"信息不能从蛋白质回到核酸"，逆转录和 RNA 复制都不违反它。
- 基因表达是基因的信息被读出并合成功能产物（蛋白质或功能性 RNA）的过程；蛋白编码基因的表达包括转录和翻译。
02遗传学基础：从孟德尔到染色体
高中生物回顾。后面讲分子机制时，会不断用到这些词。
在人们知道 DNA 是什么之前，遗传学家已经通过观察"性状怎样从父母传给子女"总结出了遗传规律。这些规律今天依然是工作语言：客户说"纯合敲除小鼠""杂合突变""隐性遗传病"，用的都是这一套词汇。本节先把它们讲清楚，下一节再进入分子层面。
染色体与同源染色体
人体的每个普通细胞（体细胞）里有 46 条染色体，组成 23 对。其中 22 对是男女都一样的常染色体，按大小编号为 1–22 号；剩下 1 对是决定性别的性染色体，女性为 XX，男性为 XY。每一对里的两条染色体，一条来自父亲、一条来自母亲，大小形状相同，在相同的位置上携带同一组基因，叫同源染色体。
因为每种染色体都有两份，体细胞被称为二倍体。精子和卵子是例外：它们在形成过程中每对同源染色体只分到一条，只有 23 条，称为单倍体；受精后精卵结合，又恢复成 46 条。所以说"人类基因组约 30 亿个碱基对"时，指的是一套 23 条（单倍体）的长度。
基因、等位基因与基因型
基因（gene）是遗传的基本单位，是染色体上一段有特定位置的 DNA，它通常决定一个功能产物（多数是蛋白质，下一节给出更准确的定义）。基因在染色体上的固定位置叫基因座。由于同源染色体成对存在，每个人的每个基因（除男性 X、Y 上的大部分基因外）都有两份。
同一个基因在人群中可能存在几种不同的"版本"，它们的 DNA 序列有少许差别，这些版本叫等位基因（allele）。等位基因的差别本质上就是第 08 节要讲的突变：可能只差一个碱基，也可能多一段或少一段。
| 术语 | 含义 | 例子（豌豆花色基因：P 紫色，p 白色） |
|---|---|---|
| 基因型（genotype） | 一个个体在某个基因上携带的两个等位基因的组合 | PP、Pp 或 pp |
| 表型（phenotype） | 可以观察或测量到的性状，由基因型和环境共同决定 | 紫花或白花 |
| 纯合子（homozygous） | 两个等位基因相同 | PP（显性纯合）、pp（隐性纯合） |
| 杂合子（heterozygous） | 两个等位基因不同 | Pp |
| 显性（dominant） | 杂合时能表现出来的那个等位基因，习惯用大写字母 | P：Pp 开紫花 |
| 隐性（recessive） | 只有纯合时才表现出来的等位基因，习惯用小写字母 | p：只有 pp 才开白花 |
显性和隐性在分子层面常常很好理解：紫色由一种合成色素的酶决定。P 等位基因能做出有功能的酶；p 等位基因带有突变，做不出有功能的酶。杂合子 Pp 里有一份好的基因，产生的酶已经足够把花染成紫色，所以 P 表现为显性；只有 pp 两份都坏了，才完全没有色素，开白花。很多隐性遗传病也是这个道理，例如第 08 节的镰刀型细胞贫血症：两条 11 号染色体上的 HBB 基因都带突变（纯合）才发病，只带一个突变拷贝的杂合子一般不发病，称为携带者。
孟德尔的分离定律：一个简例
19 世纪 60 年代，奥地利修道士孟德尔用豌豆做杂交实验，发现了分离定律：每个个体的每个基因有两个等位基因；形成配子（精子或卵子）时，这两个等位基因彼此分开，每个配子只得到其中一个；受精时，雌雄配子随机结合。下图是两株杂合紫花豌豆（Pp）杂交的结果：
为什么是 3:1？每个亲本产生 P 和 p 配子的机会各半，两个配子组合成 PP、Pp、pP、pp 四种情况，机会相等。其中 Pp 和 pP 是同一种基因型，所以基因型比为 1:2:1；PP 和 Pp 都表现为紫花，所以表型比为 3:1。这个规律的物质基础，就是减数分裂时同源染色体彼此分开、分别进入不同的配子。
基因与性状：多数不是"一个基因决定一个性状"
豌豆花色、镰刀型细胞贫血症、ABO 血型这类性状主要由一个基因决定，规律清晰，是教学的好例子。但它们是少数。人的大多数性状（身高、体重、血压、患糖尿病的风险等）受很多个基因共同影响，每个基因的贡献都很小，同时还受环境影响，这类性状叫多基因性状。例如身高与成百上千个基因位点的差异有关，营养和健康状况也会明显影响最终身高。可以把它概括成一句话：表型 = 基因型 + 环境。
两株杂合的紫花豌豆（Pp）杂交，后代中开白花（pp）的比例约是多少？
本节要点
- 人体细胞有 46 条染色体（23 对：22 对常染色体 + 1 对性染色体），每对同源染色体一条来自父亲、一条来自母亲；精子和卵子只有 23 条。
- 基因是染色体上有固定位置的一段 DNA；同一基因的不同版本叫等位基因，每个人的大多数基因都有两个等位基因。
- 基因型是等位基因的组合，表型是表现出来的性状；两个等位基因相同为纯合子，不同为杂合子。
- 显性等位基因在杂合时就能表现，隐性等位基因只有纯合时才表现；常见原因是一份有功能的基因已经足够。
- 分离定律：形成配子时两个等位基因分开，因此 Aa × Aa 的后代基因型约为 1:2:1，表型约为 3:1。
- 多数性状由多个基因和环境共同决定，只有少数性状主要由单个基因决定。
03基因组与基因：信息存在哪里
从染色体一路放大到一个基因，再看清一个基因由哪些"零件"组成。
基因组（genome）是一个生物全部遗传信息的总和。人体细胞的 DNA 分装在 46 条染色体（23 对，上一节讲过）上，每条染色体就是一根极长的、连续的 DNA 分子，再加上与它结合的蛋白质。一个人体细胞里所有 DNA 首尾相接约有 2 米长，却要装进直径只有几微米的细胞核，靠的是层层缠绕和折叠：
- 核小体（nucleosome）：DNA 先在由 8 个组蛋白（histone）组成的"线轴"上缠绕不到两圈（约 147 个碱基对），形成一个核小体。核小体之间由一小段 DNA 相连，在电镜下像一串"珠子"。
- 染色质（chromatin）：DNA 与组蛋白等蛋白质结合形成的整体叫染色质，是细胞平时（不分裂时）DNA 的存在形式。染色质有松有紧：松散的区域，RNA 聚合酶容易进去读取，基因较活跃；紧密的区域，基因通常处于关闭状态。第 09 节的"表观遗传"调控，正是通过改变松紧来开关基因。
- 染色体（chromosome）：细胞分裂时，染色质进一步高度凝缩，成为光学显微镜下能看到的一条条染色体，便于平均分给两个子细胞。
细菌没有细胞核，大肠杆菌的基因组是一条环状 DNA，直接盘绕在细胞质中一个叫拟核的区域，不形成真核细胞那样的核小体。很多细菌还带有独立于染色体之外的小型环状 DNA，叫质粒，它是基因工程最常用的"载体"（M4 详讲）。
人类数据来自人类基因组计划（2001 年草图、2003 年基本完成，2022 年首个无缺口序列）及后续基因注释；大肠杆菌数据为 K-12 菌株的常见数值。
人类基因组的 98% 以上并不直接编码蛋白质。这些序列包括：基因内部的内含子、控制基因开关的调控序列、编码各种功能性 RNA 的基因，以及占基因组近一半的、由"跳跃基因"（转座子）演化来的重复序列。过去它们被称为"垃圾 DNA"，现在知道其中相当一部分有调控等功能，但具体比例仍有争议。
那么什么是基因（gene）？比较稳妥的定义是：能产生一个功能产物（蛋白质或功能性 RNA）的一段 DNA，包括被转录的部分和控制它表达的调控序列。注意基因不等于"编码区"：一个基因里真正翻译成氨基酸的部分，往往只占一小部分。
一个真核基因的结构
上半部分是 DNA 上的基因，下半部分是它加工后得到的成熟 mRNA。点击上半部分的各个区域查看说明。
👆 点击上图中基因的任意区域，查看它的介绍。
增强子（enhancer）
一段能"远程"增强基因转录的调控序列，可以位于基因上游、下游甚至内含子里，距离可达数千到数万碱基。特定的转录因子结合在增强子上后，DNA 弯折，把它们带到启动子附近帮忙。
不同组织使用不同的增强子，这是"同一套基因组、不同细胞表达不同基因"的重要原因之一。
启动子（promoter）与转录起点
位于基因上游、RNA 聚合酶和转录因子结合的"起跑线"。它决定从哪里开始转录、朝哪个方向转录，以及转录的强弱。很多真核启动子在转录起点上游约 25–30 个碱基处有一段富含 T 和 A 的"TATA 盒"。
启动子本身不会出现在 mRNA 里。
🧬 表达载体的核心元件之一就是启动子：在哺乳动物细胞里常用 CMV 启动子，在大肠杆菌 pET 系统里用 T7 启动子（M4 详讲）。
5' 非翻译区（5'UTR）
从转录起点到起始密码子之前的一段序列。它会被转录进 mRNA，但不翻译成氨基酸。
它的作用是帮助核糖体结合并找到起始密码子。真核生物起始密码子周围的序列（Kozak 序列，典型如 GCCRCCAUGG，R 代表 A 或 G）影响起始效率；细菌则在起始密码子上游约 8 个碱基处有一段 SD 序列（核糖体结合位点）。
起始密码子 ATG（mRNA 上是 AUG）
翻译从这里开始，它同时编码甲硫氨酸（Met），所以新合成的蛋白几乎都以 Met 开头（有些之后会被切掉）。
从起始密码子到终止密码子的这段连续密码子，就是开放阅读框（ORF）。
编码区（CDS）与外显子
深蓝色部分是真正翻译成氨基酸的序列，合称编码区（coding sequence，CDS）。在真核基因中，编码区被内含子切成几段，分布在不同的外显子上。
注意：外显子 ≠ 编码区。第一个和最后一个外显子里还包含 UTR。外显子的准确定义是"会保留在成熟 RNA 中的部分"。
🧬 基因合成订单里客户要的通常就是 CDS，也就是把各段外显子编码部分拼起来的连续序列。
内含子（intron）
插在外显子之间、会被转录但随后被剪接掉的序列。大多数内含子以 GU 开头、以 AG 结尾（在 DNA 上是 GT…AG），这是剪接体识别的信号之一。
人类基因的内含子通常远长于外显子，所以一个基因在基因组上可以长达几万甚至上百万碱基，而它的 mRNA 只有几千个碱基。
细菌的基因基本没有内含子，也没有剪接体，这正是"在细菌里表达人基因必须用 cDNA"的原因（第 05 节）。
终止密码子（TAA / TAG / TGA）
翻译到这里停止。mRNA 上对应 UAA、UAG、UGA，没有 tRNA 能识别它们，而是由一种叫"释放因子"的蛋白识别，使多肽链释放。
注意：终止密码子标志着翻译的终点，而不是转录的终点，转录会继续进行到 3'UTR 之后。
3' 非翻译区（3'UTR）
终止密码子之后的序列，被转录但不翻译。真核基因的 3'UTR 中通常含有 AAUAAA 加尾信号，指示在下游切断 RNA 并加上 poly(A) 尾。
3'UTR 还影响 mRNA 的稳定性和翻译效率，很多 microRNA 就结合在这里调节基因表达。
转录终止区 / 终止子（terminator）
告诉 RNA 聚合酶"到这里停下"的 DNA 序列，位于基因末端。细菌的终止子转录成 RNA 后会折叠成发夹结构、后面跟一串 U，使聚合酶脱落。
真核蛋白编码基因的转录终止与加尾信号相关联：RNA 在加尾信号下游被切断并加上 poly(A) 尾，聚合酶随后从 DNA 上脱落。
🧬 表达载体在目标基因后面通常要放一个终止子或加尾信号（如 SV40、BGH polyA），保证转录在正确的位置结束。
基因的"零件"一览
上图每个区域的要点汇总如下，按从上游（5'）到下游（3'）的顺序排列。最关键的是分清三件事：哪些会被转录进 RNA、哪些会留在成熟 mRNA 里、哪些真正被翻译成氨基酸。
| 元件 | 是什么、做什么 | 转录进 RNA？ | 翻译成氨基酸？ |
|---|---|---|---|
| 增强子 / 沉默子 | 可以离基因很远的调控序列，结合特定的蛋白（转录因子）后放大（增强子）或压低（沉默子）转录 | 否 | 否 |
| 启动子（promoter） | 基因上游供 RNA 聚合酶和转录因子结合的"起跑线"，决定从哪里开始、朝哪个方向、以多大强度转录。很多真核启动子含 TATA 盒 | 否 | 否 |
| 转录起始位点（TSS） | RNA 的第一个核苷酸对应的位置，常记作 +1；它上游的位置记为负数（如 −10、−35） | 从这里开始转录 | 否 |
| 5' 非翻译区（5'UTR） | 转录起点到起始密码子之间的序列，帮助核糖体结合并找到起始密码子 | 是 | 否 |
| 起始密码子 ATG | 翻译的起点，编码甲硫氨酸（Met）；mRNA 上写作 AUG | 是 | 是 |
| 编码区（CDS） | 真正被翻译成氨基酸的序列，从起始密码子到终止密码子；在真核基因中被内含子分隔在几个外显子上 | 是 | 是 |
| 外显子（exon） | 会保留在成熟 RNA 中的部分。它不等于编码区：第一个和最后一个外显子里还包含 UTR | 是 | 其中的 CDS 部分翻译 |
| 内含子（intron） | 插在外显子之间、转录后被剪接切除的序列，多数以 GT 开头、以 AG 结尾 | 是（随后被切掉） | 否 |
| 终止密码子 TAA/TAG/TGA | 翻译的终点。没有 tRNA 能识别它，而是由一种叫释放因子的蛋白识别，使肽链释放。它是翻译的终点，不是转录的终点 | 是 | 否 |
| 3' 非翻译区（3'UTR） | 终止密码子之后的序列，含加尾信号 AAUAAA，影响 mRNA 的稳定性和翻译效率 | 是 | 否 |
| 终止子 / 终止区 | 让 RNA 聚合酶停止转录、脱离 DNA 的序列 | 部分转录后脱落 | 否 |
还有两个常被混用的词：CDS（coding sequence，编码序列）指数据库注释中实际被翻译的那一段；ORF（open reading frame，开放阅读框）指从起始密码子开始、到终止密码子结束、中间没有其他终止密码子的一段连续密码子，是从序列本身"看出来"的（第 06 节详讲）。对一条成熟 mRNA 来说，它的 CDS 就是一个 ORF。
| 原核基因（如大肠杆菌） | 真核基因（如人） | |
|---|---|---|
| 基因组存放 | 通常一条环状染色体，在细胞质中（无细胞核）；常另带质粒 | 多条线性染色体，DNA 缠绕组蛋白形成染色质，存放在细胞核中 |
| 内含子 | 基本没有，编码区连续 | 大多数基因都有，需要剪接 |
| 基因排列 | 功能相关的几个基因常串在一起，共用一个启动子，转录成一条 mRNA（操纵子） | 一般一个基因一个启动子、一条 mRNA 只翻译出一种蛋白 |
| 核糖体如何找到起点 | 识别起始密码子上游的 SD 序列 | 结合 mRNA 的 5' 帽，向下游扫描到第一个合适的 AUG |
| 转录与翻译 | 都在细胞质中，可以边转录边翻译 | 转录在细胞核内，mRNA 加工后出核再翻译 |
NM_ 开头的是 mRNA 记录，NP_ 是蛋白记录，NC_/NG_ 是基因组序列。mRNA 记录里包含 5'UTR、CDS 和 3'UTR，记录中标注为 "CDS" 的坐标范围才是需要表达的部分。搞清楚这些区域，就能听懂客户说的"我只要 CDS""要不要带 UTR"。本节要点
- DNA 缠绕在组蛋白上形成核小体，DNA 与蛋白质一起构成染色质；细胞分裂时染色质凝缩成染色体。
- 人类基因组约 30 亿个碱基对、约 2 万个蛋白编码基因，真正编码蛋白质的序列只占约 1–2%。
- 一个基因从上游到下游依次有启动子、转录起始位点、5'UTR、编码区（CDS，从 ATG 到终止密码子）、3'UTR 和终止区；启动子不转录，UTR 转录但不翻译。
- 真核基因的编码区被内含子隔开，外显子是保留在成熟 RNA 中的部分，外显子不等于编码区。
- 原核基因基本没有内含子，功能相关的基因常组成共用一个启动子的操纵子；核糖体靠 SD 序列找起点，转录和翻译可同时进行。
- 终止密码子不被任何 tRNA 识别，而是由释放因子识别。
04DNA 复制：一份变两份
每次细胞分裂前，几十亿个碱基对都要被精确复制一遍。
1953 年，沃森和克里克在提出双螺旋模型的论文结尾写了一句后来很有名的话："我们注意到，我们所假设的特异性配对立即提示了一种可能的遗传物质复制机制。"既然 A 只和 T 配对、G 只和 C 配对，一条链就足以确定另一条链的序列，两条链分开后各自作模板，就能得到两份相同的 DNA。
半保留复制：梅塞尔森–斯塔尔实验（1958）
当时有三种猜想：全保留（原来的双链完整保留，另合成一条全新的双链）、半保留（每个新 DNA 由一条旧链和一条新链组成）、弥散（新旧片段混杂在每条链中）。梅塞尔森和斯塔尔设计了一个被誉为"生物学最美实验"之一的方案来区分它们：
第 1 代只出现一条中间密度的带，说明每个 DNA 分子都是"一半重、一半轻"，否定了全保留复制（那样应出现一重一轻两条带）。第 2 代出现中间带和轻带各一条，又否定了弥散复制（那样所有 DNA 应逐代变轻，始终只有一条带）。结论：DNA 复制是半保留的。
如果 DNA 是"全保留复制"，第 1 代离心后应该看到什么？
复制机器：一支分工明确的团队
解旋酶
像拉链头一样沿 DNA 前进，打开碱基之间的氢键，把双链分开，形成 Y 形的"复制叉"。
单链结合蛋白 · 拓扑异构酶
前者包住暴露的单链防止重新配对；后者在前方切开再接上 DNA，释放解旋造成的扭曲张力。
引物酶
合成一小段 RNA 引物（约 10 个核苷酸）。DNA 聚合酶不能"从零开始"，只能在已有链的末端接着加。
DNA 聚合酶
按碱基配对规则把核苷酸接到新链的 3' 端，因此新链只能沿 5'→3' 方向延伸。还会边合成边校对。
DNA 连接酶
把相邻 DNA 片段之间的缺口"焊"上，形成连续的链。基因工程中拼接 DNA 片段用的也是它（M4）。
关键矛盾在于：DNA 两条链方向相反，而聚合酶只能单向工作。复制叉向前推进时，有一条模板链让新链刚好可以"顺着"复制叉的方向连续合成，称为前导链；另一条新链的合成方向与复制叉前进方向相反，只能等复制叉打开一段，就合成一小段，再打开再合成，称为后随链。后随链上的这些小片段叫冈崎片段，以 1960 年代末发现它们的日本科学家冈崎令治命名，细菌中约 1000–2000 个核苷酸长，真核细胞中约 100–200 个。
复制从染色体上特定的复制起点开始，向两侧各形成一个复制叉。大肠杆菌的环状染色体只有一个复制起点；人的每条染色体上有大量起点，全基因组合计数以万计，同时开工才能在几小时内复制完。因为每个冈崎片段都要从一段 RNA 引物起头，后随链上会留下许多引物和缺口：RNA 引物随后被切除、换成 DNA，最后由 DNA 连接酶把相邻片段连成一条完整的链。下面的动画把这些步骤串起来。
复制叉向右推进。深蓝色是两条旧的模板链，绿色是新合成的 DNA，红色是 RNA 引物。点击"下一步"逐步观看。
① 解旋：打开双螺旋
复制从特定的"复制起点"开始。解旋酶打开双链，形成复制叉；单链结合蛋白护住暴露的单链；拓扑异构酶在前方释放扭曲张力。大肠杆菌的环状染色体只有一个复制起点，人类每条染色体上有大量起点，全基因组合计数以万计，同时开工才能在几小时内复制完。
② 铺引物：给聚合酶一个"起点"
DNA 聚合酶只能在已有链的 3' 端延伸，不能凭空开始。引物酶先合成一小段 RNA 引物（红色）。前导链只需要在起点铺一次引物；后随链则每个片段都需要一个新引物。
③ 前导链：顺着复制叉连续合成
DNA 聚合酶沿 5'→3' 方向，一边读模板一边添加配对的核苷酸。前导链的延伸方向与复制叉前进方向一致，可以一口气合成到底。大肠杆菌的聚合酶每秒可添加约 1000 个核苷酸。同时，后随链的第一个片段也在向左合成。
④ 后随链：一段一段倒着合成
后随链的合成方向与复制叉前进方向相反。复制叉每打开一段，引物酶就在靠近叉口处铺一个新引物，聚合酶再向左合成，直到碰上前一个片段，形成一个个冈崎片段。
⑤ 换引物、补缺口、封口
RNA 引物不能留在 DNA 里。另一种 DNA 聚合酶把引物切除，并用 DNA 填补空缺（浅绿色）；最后 DNA 连接酶把相邻片段之间的切口连上，后随链成为连续的长链。图中右侧那段红色引物，会在下一个片段合成后被同样替换。
⑥ 校对：错误率低到惊人
DNA 聚合酶偶尔会放错碱基。很多聚合酶带有 3'→5' 外切酶活性，发现错配就退回一步切掉，再重新添加，这就是"校对"。按教科书的常见估算，单靠碱基配对选择约每 10⁵ 个出错 1 个，加上校对降到约 10⁷ 分之一，再经过复制后的错配修复系统，最终约 10⁹–10¹⁰ 个碱基才错 1 个。
校对与错误率：为什么复制如此精确
DNA 聚合酶偶尔会放错碱基。很多 DNA 聚合酶除了"往前加"之外，还能"往回切"：它们带有 3'→5' 外切酶活性，发现刚加上的碱基配错了，就退回一步把它切掉，再重新添加，这叫校对（proofreading）。复制完成后，细胞还有专门的错配修复系统扫描新链、改正漏网的错误。层层把关之下，按教科书的常见估算：
也就是说，复制一个约 30 亿碱基对的人类基因组，按这个错误率估算，每次细胞分裂平均只会留下个位数甚至不到一个新错误。漏网的错误如果没被修复，就成为突变（第 08 节）。
线性染色体还有一个"末端难题"：后随链最末端的引物被切除后无法补齐，所以每复制一次，染色体末端就会变短一点。染色体末端那段不编码基因的重复序列叫端粒（telomere），它像鞋带头的塑料套一样保护染色体，并为这种缩短提供缓冲。
| 细胞内的 DNA 复制 | 试管里的 PCR | |
|---|---|---|
| 分开双链 | 解旋酶 | 加热到约 94–98 °C 使双链变性 |
| 引物 | 引物酶现场合成的 RNA 引物 | 人工合成的两条 DNA 引物，决定扩增哪一段 |
| 聚合酶 | 细胞自己的 DNA 聚合酶 | 耐高温的聚合酶，如 Taq 酶；高保真酶带校对功能 |
| 延伸方向 | 新链只能 5'→3' 延伸，因此有前导链和后随链 | 同样只能 5'→3' 延伸，所以引物必须结合在要扩增片段的两端、彼此"相向" |
| 复制范围 | 整个基因组，每次分裂复制一次 | 只扩增两条引物之间的片段，每个循环数量约翻倍 |
常用的 Taq 酶没有 3'→5' 校对活性，错误率较高；克隆、基因合成等要求序列绝对准确的场合，会选用带校对功能的高保真聚合酶，最终还要通过测序确认每一个碱基。PCR 的温度循环、引物设计等细节在 M4 详细讲。
端粒：线性染色体的"末端难题"
后随链最末端的引物被切除后，没有更上游的片段可以帮它补上，所以线性染色体每复制一次，末端就会变短一点。染色体末端有一段不编码基因的重复序列叫端粒，像鞋带头的塑料套一样起保护作用。
生殖细胞、干细胞和多数癌细胞中有端粒酶，它自带一段 RNA 模板，用逆转录的方式把端粒补长，这又是"RNA→DNA"的一个例子。布莱克本、格雷德和绍斯塔克因端粒和端粒酶的研究获得 2009 年诺贝尔生理学或医学奖。细菌的染色体是环状的，没有这个问题。
大肠杆菌复制一次染色体约需 40 分钟，为什么能 20 分钟分裂一次？
在营养充足时，大肠杆菌不等上一轮复制结束，就从复制起点开始新一轮复制，一条染色体上同时有多组复制叉在工作。这样子细胞"出生"时就已经带着一条正在复制的染色体，从而突破了单轮复制时间的限制。
本节要点
- DNA 复制是半保留的：每个新 DNA 由一条旧链和一条新链组成，梅塞尔森–斯塔尔实验第 1 代只有中间带排除了全保留，第 2 代出现中间带加轻带排除了弥散复制。
- 解旋酶打开双链，单链结合蛋白护住单链，引物酶合成 RNA 引物，DNA 聚合酶延伸新链，DNA 连接酶封口。
- DNA 聚合酶只能沿 5'→3' 方向延伸且需要引物，所以前导链连续合成，后随链分成冈崎片段合成。
- 聚合酶的校对（3'→5' 外切酶活性）加上错配修复，使最终错误率约为 10⁻⁹–10⁻¹⁰；线性染色体末端有端粒保护。
- PCR 是试管里的复制：用加热代替解旋酶、用人工 DNA 引物代替 RNA 引物、用耐高温聚合酶扩增两条引物之间的片段。
05转录：把 DNA 抄成 RNA
读懂"模板链"和"编码链"，是读懂所有序列文件的前提。
转录（transcription）就是以 DNA 的一段为模板合成 RNA。回顾 M2：RNA 和 DNA 的区别有三点，五碳糖是核糖而不是脱氧核糖；用尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T）；通常是单链。细胞里的 RNA 主要有三类：携带蛋白质"配方"的 mRNA（信使 RNA）、搬运氨基酸的 tRNA（转运 RNA）、构成核糖体的 rRNA（核糖体 RNA）。按质量算，rRNA 约占细胞 RNA 的八成，mRNA 只占几个百分点，但种类最多。
只有 mRNA 会被翻译成蛋白质，其余的 RNA 统称非编码 RNA（ncRNA），它们本身就是功能产物。除了 tRNA 和 rRNA，还有几类在后面会遇到：
| RNA 类型 | 做什么 | 本模块 / 课程中出现的地方 |
|---|---|---|
| mRNA（信使 RNA） | 携带编码蛋白质的序列，被核糖体翻译 | 本节、第 07 节；mRNA 疫苗（第 11 节） |
| tRNA（转运 RNA） | 约 76 个核苷酸，一端用反密码子"认"密码子，另一端携带氨基酸 | 翻译（第 07 节） |
| rRNA（核糖体 RNA） | 与蛋白质一起组成核糖体，并催化肽键形成 | 翻译（第 07 节） |
| snRNA（核小 RNA） | 剪接体的核心成分，帮助识别和切除内含子 | mRNA 加工（本节） |
| miRNA（微 RNA） | 约 22 个核苷酸的小 RNA，由细胞自己的基因编码，结合 mRNA 抑制其翻译或促进降解 | 基因表达调控（第 09 节） |
| siRNA（小干扰 RNA） | 约 21 个核苷酸的双链小 RNA，常人工设计，引导与它完全互补的 mRNA 被切割 | RNA 干扰（第 09 节）；核酸药物（M7） |
| lncRNA（长链非编码 RNA） | 长度超过 200 个核苷酸、不编码蛋白的 RNA，很多参与调控基因表达，功能仍在研究中 | 了解即可 |
RNA 聚合酶与两条链的分工
RNA 聚合酶结合到启动子上，局部解开 DNA 双链（形成"转录泡"），以其中一条链为模板，按 A–U、T–A、G–C、C–G 的规则合成 RNA。和 DNA 聚合酶不同，它不需要引物，可以直接起头；但同样只能沿 5'→3' 方向合成新链，因此它沿模板链的 3'→5' 方向读取。
被读取的那条叫模板链（也叫反义链）；另一条叫编码链（也叫有义链），因为它的序列和 mRNA 一样，只是 T 换成 U。数据库、论文和基因合成订单里写出来的"基因序列"，按惯例都是编码链，从 5' 写到 3'。所以拿到一段以 ATG 开头的序列，直接把 T 换成 U 就是 mRNA，可以直接查密码子表。
某基因模板链的一段序列写作 5'-TTACGCCAT-3'，转录出的 mRNA 是？
从哪里开始，到哪里结束
转录从启动子开始：RNA 聚合酶在启动子上就位，从转录起始位点（+1）开始合成 RNA，一直进行到基因末端的终止区才停下。细菌和真核细胞在"谁来识别启动子""怎么停下"上做法不同：
| 细菌（原核） | 真核细胞 | |
|---|---|---|
| RNA 聚合酶 | 只有一种，由不同的 σ（sigma）因子帮它认启动子。细菌有多种 σ 因子，分别识别不同类别的启动子，例如受热时启用专门的 σ 因子来打开热休克基因 | 三种主要的：RNA 聚合酶 II 转录蛋白编码基因（mRNA），I 和 III 主要转录 rRNA、tRNA 等 |
| 启动子的识别 | σ 因子识别约 −10 位的 TATAAT 和约 −35 位的 TTGACA | 聚合酶 II 不能单独识别启动子，需要一组通用转录因子先结合到 TATA 盒等元件上，再把聚合酶招募过来 |
| 终止 | 终止子：RNA 折叠成发夹、后面跟一串 U，聚合酶脱落（另一类需要 ρ 蛋白帮助） | RNA 在加尾信号下游被切断并加尾，聚合酶随后脱落 |
| 产物 | mRNA 可直接翻译，转录还没结束核糖体就能开工 | 前体 mRNA 要在核内加工（下文），再经核孔出核 |
下面两个标签页补充了一些细节和小故事：
细菌只有一种 RNA 聚合酶，它与一个叫 σ 因子的蛋白结合后才能识别启动子。典型的细菌启动子在转录起点上游有两段保守序列：约 −10 位的 TATAAT 和约 −35 位的 TTGACA。实际启动子越接近这两段"标准答案"，通常越强。
转录终止常靠终止子：RNA 上一段能自身折叠成发夹结构、后面跟着一串 U 的序列，使聚合酶脱落；另一类终止需要一种叫 ρ（Rho）的蛋白帮助。
真核细胞有三种主要的 RNA 聚合酶：RNA 聚合酶 II 负责转录编码蛋白质的基因（mRNA），I 和 III 主要转录 rRNA、tRNA 等。聚合酶 II 不能单独识别启动子，需要一组"通用转录因子"先结合到 TATA 盒等元件上，再把聚合酶招募过来。
毒蘑菇中的 α-鹅膏蕈碱能强烈抑制 RNA 聚合酶 II，阻断 mRNA 合成，这是毒蘑菇致命的原因之一；抗生素利福平则抑制细菌的 RNA 聚合酶，用于治疗结核病。
真核 mRNA 的三步加工
真核细胞刚转录出来的是前体 mRNA（pre-mRNA），要经过三步加工才变成能出核翻译的成熟 mRNA。这三步大多在转录进行的同时就开始了：
加 5' 帽
在 RNA 的 5' 端接上一个特殊的 7-甲基鸟苷。它保护 mRNA 不被降解，也是核糖体识别并开始扫描的"把手"。
剪接
由剪接体（多种 RNA 和蛋白组成的复合物）切除内含子，把外显子按顺序连接起来。
加 poly(A) 尾
在加尾信号下游切断 RNA，再加上一串腺苷酸（哺乳动物中常见约 200 个）。尾巴越长，mRNA 一般越稳定。
加工完成的成熟 mRNA 通过核膜上的核孔运出细胞核，进入细胞质等待翻译（核孔见 M1）。5' 帽和 poly(A) 尾既保护 mRNA 两端不被降解酶"啃"掉，也帮助核糖体高效起始翻译，所以人工合成的 mRNA 也必须带上它们（第 11 节）。
可变剪接让一个基因产生多种蛋白质。据估算，人类超过 90% 的多外显子基因存在可变剪接，这部分解释了为什么人只有约 2 万个蛋白编码基因，却能产生种类多得多的蛋白质。一个极端例子是果蝇的 Dscam 基因，理论上可剪接出 38016 种不同的 mRNA。和工作相关的例子是抗体：B 细胞中同一个抗体重链基因，通过 RNA 3' 端加工和剪接方式的不同，既能产生锚定在细胞膜上的抗体（作为 B 细胞的受体），也能产生分泌到体外的抗体。
cDNA：把"剪好的"信息倒抄回 DNA
用逆转录酶以成熟 mRNA 为模板合成的 DNA，叫互补 DNA（cDNA）。实验中常用一段寡聚 dT 引物（一串 T）结合 mRNA 的 poly(A) 尾，让逆转录酶从这里开始合成。由于 mRNA 已经剪接过，cDNA 没有内含子，基本就是 5'UTR + CDS + 3'UTR。
下面这些关于转录和翻译的特征，分别属于哪类细胞？
原核细胞
真核细胞
两者都有
本节要点
- RNA 聚合酶结合启动子，以模板链为模板、不需要引物、沿 5'→3' 方向合成 RNA。
- mRNA 与模板链互补，与编码链序列相同（T 换成 U）；数据库和订单里写的基因序列按惯例是 5'→3' 的编码链。
- 主要的 RNA 有 mRNA、tRNA、rRNA 三类，另有 snRNA、miRNA、siRNA、lncRNA 等非编码 RNA。
- 细菌只有一种 RNA 聚合酶，靠不同 σ 因子识别启动子；真核的 RNA 聚合酶 II 转录 mRNA，需要通用转录因子帮助。
- 真核前体 mRNA 要加 5' 帽、剪接（剪接体切除内含子）、加 poly(A) 尾，再经核孔出核；可变剪接让一个基因产生多种蛋白。
- cDNA 是由成熟 mRNA 逆转录得到的、不含内含子的 DNA；细菌没有剪接体，所以在大肠杆菌中表达人蛋白要用 cDNA 或只含 CDS 的合成基因。
06遗传密码：三个字母一个词
4 种碱基如何表示 20 种氨基酸？答案是一本 64 个"词条"的密码本。
先做一道算术题：如果 1 个碱基对应 1 个氨基酸，只能表示 4 种；2 个碱基一组，4² = 16 种，还是不够 20；3 个碱基一组，4³ = 64 种，绰绰有余。1961 年，克里克和布伦纳等人用噬菌体的移码突变实验证明了密码确实是"三个一组"；同年，尼伦伯格和马太用人工合成的全 U 序列（poly-U）在无细胞体系中得到了只含苯丙氨酸的多肽，破译了第一个密码子 UUU = 苯丙氨酸。到 1966 年前后，全部 64 个密码子被破译，霍利、科拉纳和尼伦伯格因此获得 1968 年诺贝尔生理学或医学奖。
遗传密码的六个特点
3 个碱基 = 1 个密码子
mRNA 上每 3 个相邻碱基构成一个密码子，对应一个氨基酸或"终止"信号。
连续、不重叠
从起点开始一个接一个地读，中间没有分隔符，也不跳读。所以起点决定了一切。
AUG
既是起始信号，也编码甲硫氨酸（Met）。出现在序列中间的 AUG 只编码 Met。
UAA、UAG、UGA
3 个终止密码子不编码氨基酸。64 − 3 = 61 个密码子编码 20 种氨基酸。
多个密码子对应同一个氨基酸
除 Met 和 Trp 外，每种氨基酸都有 2–6 个"同义密码子"，差异大多在第三位。这降低了突变的危害，也给了密码子优化空间。
几乎所有生物共用
从细菌到人基本使用同一套密码，所以人的基因能在大肠杆菌里表达。少数例外，如人线粒体中 UGA 编码色氨酸而不是终止。
表格按"第一位（左）× 第二位（上）× 第三位（右）"排列。点击任意密码子或上方的氨基酸按钮，高亮它的全部同义密码子。
阅读框：从哪里开始读，决定读出什么
因为密码没有标点，同一段序列从第 1、2、3 个碱基开始读，会得到三套完全不同的密码子，称为三个阅读框。DNA 是双链，另一条链上还有三个，所以一段 DNA 共有 6 个可能的阅读框。从 AUG 开始、到终止密码子结束、中间没有其他终止密码子的一段阅读框，叫开放阅读框（ORF）。随机序列中每 64 个密码子就有 3 个是终止密码子，平均约 20 个密码子就会碰到一个，所以一段长达几百个密码子的 ORF 往往提示它是真正的基因。
粘贴一段 DNA（编码链）或 mRNA 序列，选择阅读框，查看 mRNA、三字母和单字母氨基酸序列。空格、换行、数字和 FASTA 标题行（以 > 开头）会被自动忽略。
绿色 = 起始密码子 AUG；红色 = 终止密码子。单字母序列中的 * 表示终止。
通用性：为什么能在大肠杆菌里生产人的蛋白
从细菌、酵母到人，几乎所有生物都使用同一套标准遗传密码。这说明今天的生物来自共同的祖先，也给生物技术带来了最大的便利：把人的一段编码序列放进大肠杆菌、酵母或昆虫细胞，它们的核糖体会按同一本密码本读出同样的氨基酸序列。胰岛素就是最早的例子之一：1980 年代起，人胰岛素就可以用改造过的大肠杆菌生产，而不再只能从动物胰腺中提取。
但"密码通用"不等于"放进去就能表达"。还要处理好几件事，它们分别对应本模块的其他小节：人基因有内含子而细菌不会剪接，所以要用 cDNA 或 CDS（第 05 节）；要换上宿主能识别的启动子和核糖体结合序列（第 07、09 节）；宿主对同义密码子的偏好不同，可能需要密码子优化（第 10 节）；细菌不能像人细胞那样给蛋白加糖链等修饰（第 07 节、M5）。另外，线粒体等少数场合使用略有不同的密码，例如人线粒体中 UGA 编码色氨酸。
第 21 和第 22 种氨基酸，以及"摆动"
摆动假说：细胞里的 tRNA 种类少于 61 种，因为一个 tRNA 的反密码子第一位（对应密码子第三位）配对比较"宽松"，可以识别不止一种碱基。这是 1966 年克里克提出的"摆动"假说，也解释了为什么同义密码子的差别集中在第三位。
扩展的密码：有些生物会在特殊序列信号的帮助下，把 UGA 读成硒代半胱氨酸（人体中也有少数含硒蛋白），某些古菌和细菌会把 UAG 读成吡咯赖氨酸。科学家还能通过改造 tRNA 和配套的酶，让 UAG 位置插入人工设计的非天然氨基酸，用于蛋白质工程。
本节要点
- mRNA 上每 3 个相邻碱基是一个密码子，4³ = 64 个密码子中 61 个编码 20 种氨基酸，3 个（UAA、UAG、UGA）是终止密码子。
- AUG 既是起始密码子，又编码甲硫氨酸（Met）。
- 简并性：除 Met 和 Trp 外，每种氨基酸有 2–6 个同义密码子，差别多在第三位，这给了密码子优化空间。
- 密码连续、不重叠、无标点，起点决定阅读框；一段 DNA 有 6 个可能的阅读框，从 AUG 到终止密码子、中间无终止的一段叫 ORF。
- 遗传密码几乎通用，所以人的编码序列能在大肠杆菌中翻译出相同的蛋白，但仍需处理内含子、启动子、密码子偏好和翻译后修饰等问题。
07翻译：核糖体的装配线
把核苷酸语言翻译成氨基酸语言，需要三样东西：mRNA、tRNA 和核糖体。
核糖体
由 rRNA 和几十种蛋白组成，分大小两个亚基。细菌的是 70S（30S + 50S），真核细胞质中的是 80S（40S + 60S）。大亚基上有 A、P、E 三个 tRNA 结合位点。
tRNA
约 76 个核苷酸长，折叠成三叶草形（立体上是 L 形）。一端的三个碱基叫反密码子，与 mRNA 上的密码子反向互补配对；另一端（3' 端的 CCA）连接对应的氨基酸。
氨酰-tRNA 合成酶
通常每种氨基酸有一种专门的合成酶，消耗 ATP，把正确的氨基酸装到正确的 tRNA 上，得到"氨酰-tRNA"。它们是遗传密码真正被"执行"的地方。
核糖体的三个位点按 mRNA 上从 5' 到 3' 的方向依次排列为 E、P、A。记法：A（aminoacyl）是新的氨酰-tRNA 进入的位置；P（peptidyl）是挂着正在延长的肽链的 tRNA 所在的位置；E（exit）是空 tRNA 离开的出口。值得一提的是，催化肽键形成的不是蛋白质，而是大亚基中的 rRNA，所以核糖体本质上是一个"核酶"。阐明核糖体原子结构的三位科学家获得了 2009 年诺贝尔化学奖。
tRNA：一头认密码，一头扛氨基酸
tRNA 是连接"核酸语言"和"蛋白质语言"的翻译员。它本身并不"认识"氨基酸：真正决定哪个氨基酸接到哪个 tRNA 上的，是氨酰-tRNA 合成酶。一旦氨基酸装对了，核糖体只检查反密码子和密码子是否配对，不再检查氨基酸本身。所以遗传密码的"对照表"，实际上是由这一组合成酶执行的。
起始：核糖体怎样找到正确的 AUG
一条 mRNA 上可能有很多个 AUG，核糖体必须从正确的那一个开始，否则整个阅读框都会错。细菌和真核细胞用不同的办法定位：
| 细菌（原核） | 真核细胞 | |
|---|---|---|
| 定位信号 | SD 序列（Shine-Dalgarno 序列，又叫核糖体结合位点 RBS），典型序列类似 AGGAGG，位于起始密码子上游约 5–10 个碱基处 | Kozak 序列：起始密码子周围的一段序列，典型为 GCCRCCAUGG（R 代表 A 或 G），其中 AUG 前第 3 位的 A/G 和后一位的 G 最重要 |
| 工作方式 | SD 序列与小亚基 16S rRNA 的一段序列互补配对，把核糖体直接"放"到起始密码子上 | 小亚基先结合 mRNA 的 5' 帽，再向下游"扫描"，通常在第一个处于合适 Kozak 环境中的 AUG 处起始 |
| 一条 mRNA 编码 | 可以有多个 SD 序列，翻译出多个蛋白（操纵子） | 通常只翻译出一个蛋白 |
| 核糖体与起始氨基酸 | 70S（30S + 50S）；甲酰甲硫氨酸（fMet） | 80S（40S + 60S）；甲硫氨酸（Met） |
GCCACCATG）。把一个只带 Kozak 序列的构建放进大肠杆菌，或反过来，都可能导致表达很低。观察 tRNA 的反密码子如何与密码子配对、肽链如何从一个 tRNA 转移到下一个、核糖体如何每次移动 3 个碱基。
① 起始：找到起始密码子
核糖体小亚基与 mRNA 结合，在真核细胞中从 5' 帽开始向下游扫描，找到第一个处在合适序列环境中的 AUG（细菌则靠 SD 序列直接定位）。携带甲硫氨酸的起始 tRNA（反密码子 UAC）与 AUG 配对，占据 P 位。细菌的起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸（fMet）。
② 大亚基加入：装配线就位
大亚基结合上来，形成完整的核糖体。此时 P 位有起始 tRNA，A 位空着，正对第 2 个密码子 GCU。
③ 进位：对号入座
各种氨酰-tRNA 不断"试探"A 位，只有反密码子与密码子配对的才能留下。这里是携带丙氨酸（Ala）、反密码子为 CGA 的 tRNA。
④ 成肽：肽链"搬家"
大亚基中的 rRNA 催化，P 位 tRNA 上的 Met 脱离，与 A 位上的 Ala 形成肽键。现在二肽 Met-Ala 挂在 A 位的 tRNA 上，P 位的 tRNA 空了。
⑤ 移位：前进一个密码子
核糖体沿 mRNA 向 3' 方向移动正好 3 个碱基：空 tRNA 进入 E 位随后离开，带着二肽的 tRNA 移到 P 位，A 位空出来，对准下一个密码子 AAA。
⑥ 延伸循环：进位 → 成肽 → 移位
携带赖氨酸（Lys，反密码子 UUU）的 tRNA 进位、成肽、移位……每循环一次，肽链增加一个氨基酸。在细菌中，核糖体每秒约能添加 10–20 个氨基酸。
⑦ 终止：遇到"句号"
又经过一轮循环加上色氨酸（Trp）后，A 位来到终止密码子 UAA。没有 tRNA 能识别它，取而代之的是一种形状模仿 tRNA 的蛋白质，叫释放因子。
⑧ 释放与解离
释放因子促使肽链从最后一个 tRNA 上水解下来；核糖体两个亚基分开，可以投入下一轮翻译。新生的肽链 Met-Ala-Lys-Trp 将折叠成特定的三维结构，可能还要经过切割、糖基化等修饰，才成为有功能的蛋白质。
简化示意：真实细胞中反密码子常含修饰碱基，一种 tRNA 可通过"摆动"配对识别多个密码子。
把动画的八步归纳起来，翻译分为三个阶段：
- 起始：小亚基找到起始密码子 AUG（细菌靠 SD 序列，真核从 5' 帽扫描），携带 Met 的起始 tRNA 与 AUG 配对、占据 P 位，大亚基随后结合，组装成完整核糖体。
- 延伸：反复进行三步循环。进位：反密码子与 A 位密码子配对的氨酰-tRNA 留下；成肽：大亚基中的 rRNA 催化，把 P 位上的肽链接到 A 位的氨基酸上；移位：核糖体向 3' 方向移动 3 个碱基，空 tRNA 经 E 位离开。每循环一次，肽链加长一个氨基酸。
- 终止：A 位遇到终止密码子 UAA、UAG 或 UGA，没有 tRNA 能与之配对，由一种叫释放因子的蛋白质识别，使肽链从 tRNA 上水解释放，核糖体大小亚基随后分开。
两个方向请记牢：核糖体沿 mRNA 的 5'→3' 方向读，蛋白质从 N 端（氨基端）向 C 端（羧基端）延长。所以 DNA 序列的开头对应蛋白的 N 端，这在设计"N 端标签"还是"C 端标签"时非常有用。一条 mRNA 上常常同时有多个核糖体在依次翻译，像一串珠子，称为多聚核糖体，进一步提高了产量。
翻译之后：新生的蛋白去哪里
核糖体释放的只是一条氨基酸链（多肽链），离"能干活的蛋白质"还差几步，而且它还要被送到正确的地方。M1 讲过，真核细胞里蛋白的去向在翻译开始后不久就决定了：
- 留在细胞质（或进入细胞核、线粒体等）：多数蛋白在细胞质中游离的核糖体上合成，合成后留在细胞质，或凭借自身携带的"地址标签"被运往细胞核、线粒体等处。
- 分泌到细胞外或嵌在细胞膜上：如果新生肽链的 N 端有一段信号肽，它会把正在翻译的核糖体带到内质网表面，蛋白一边合成一边进入内质网，之后经高尔基体包装，分泌出细胞或送到细胞膜上。这就是 M1 的分泌途径，抗体、激素等分泌蛋白都走这条路；信号肽在进入内质网后通常会被切掉。
在这一路上，多肽链会折叠成特定的三维结构，往往需要"分子伴侣"蛋白帮忙；还可能经过翻译后修饰，例如形成二硫键、加上糖链（糖基化）、被蛋白酶切割、被磷酸化等。这些内容在 M5 详细展开。
用 ↑ ↓ 把下面的步骤排成正确顺序，再点"检查顺序"。
- 转录因子和 RNA 聚合酶 II 结合到启动子上
- RNA 聚合酶以模板链为模板合成前体 mRNA
- 加 5' 帽、剪接去除内含子、加 poly(A) 尾（多与转录同时进行）
- 成熟 mRNA 通过核孔进入细胞质
- 核糖体小亚基结合 5' 帽，扫描到起始密码子 AUG
- 大亚基加入，tRNA 按密码子依次送来氨基酸，肽链延长
- 核糖体遇到终止密码子，释放因子使肽链释放
- 多肽链折叠，并可能经过修饰，成为有功能的蛋白质
一条 mRNA 的编码区（从 AUG 到终止密码子，含终止密码子）共 900 个碱基，它编码的多肽链有多少个氨基酸？
本节要点
- 翻译需要 mRNA、tRNA 和核糖体：tRNA 用反密码子与密码子配对，3' 端 CCA 携带氨基酸；氨酰-tRNA 合成酶负责把正确的氨基酸装到正确的 tRNA 上。
- 核糖体由大小两个亚基组成（细菌 70S，真核 80S），A 位进入氨酰-tRNA，P 位挂着延长中的肽链，E 位是空 tRNA 的出口；催化肽键形成的是 rRNA。
- 翻译分起始、延伸（进位、成肽、移位）、终止三个阶段；终止密码子由释放因子识别。
- 细菌核糖体靠 SD 序列定位起始密码子，真核核糖体从 5' 帽扫描，起始效率受 Kozak 序列影响。
- 核糖体沿 mRNA 5'→3' 读，蛋白从 N 端向 C 端延长；多个核糖体可同时翻译一条 mRNA（多聚核糖体）。
- 带信号肽的蛋白进入内质网、经高尔基体分泌（分泌途径），并可能经过折叠、二硫键、糖基化等翻译后修饰。
08突变：一个字母的代价
DNA 序列的改变如何（或者为何不会）改变蛋白质。
突变（mutation）是 DNA 序列发生的、能随复制传下去的改变。从序列层面看，突变分为碱基替换、插入和缺失。只改变一个碱基的替换叫点突变，它按对密码子的影响又分为同义、错义、无义三种。突变对蛋白质的影响，取决于发生在哪里、改变了什么：
| 类型 | 序列变化（示例） | 对蛋白质的影响 |
|---|---|---|
| 同义（沉默）突变 | GAG → GAA，都编码谷氨酸 | 氨基酸不变，通常没有影响 |
| 错义突变 | GAG → GTG，谷氨酸变缬氨酸 | 一个氨基酸被替换，影响从无到严重不等 |
| 无义突变 | GAG → TAG，变成终止密码子 | 蛋白提前截断，通常失去功能 |
| 移码突变 | 插入或缺失 1、2 个（非 3 的倍数）碱基 | 突变点之后的阅读框全部错位，常很快遇到终止密码子 |
| 整码插入 / 缺失 | 插入或缺失 3 的倍数个碱基 | 多出或少了几个氨基酸，其余不变 |
前三行是点突变。除此之外，点突变还可能落在两个特殊的位置：起始密码子突变（ATG 被破坏，核糖体找不到正确的起点）和终止密码子丢失（终止密码子变成编码氨基酸的密码子，翻译一直读进 3'UTR，产生加长的异常蛋白）。另外，真核细胞会识别带有"提前终止密码子"的 mRNA 并主动将其降解，这个质量控制机制叫无义介导的 mRNA 降解，所以无义突变常常连截短的蛋白都很少产生。
经典案例：镰刀型细胞贫血症
成人血红蛋白由两条 α-珠蛋白链和两条 β-珠蛋白链组成。镰刀型细胞贫血症患者的 β-珠蛋白基因（HBB）发生了一个碱基替换：编码第 6 位氨基酸的 GAG 变成 GTG，谷氨酸（带负电、亲水）变成缬氨酸（疏水）。这一个疏水的"粘点"让脱氧状态下的血红蛋白互相粘连、聚合成长纤维，红细胞随之扭曲成镰刀状，变硬、易破裂、堵塞小血管。
用第 02 节的语言来说，镰刀型细胞贫血症是一种隐性遗传病：两条 11 号染色体上的 HBB 都带这个突变（纯合子）才发病；只带一个突变拷贝的杂合子一般不发病，是携带者。两个携带者生育的孩子，按分离定律约有 1/4 的概率患病。
关于编号多说一句：成熟的 β-珠蛋白切掉了开头的 Met，传统文献从下一个氨基酸开始计数，所以叫 Glu6Val；现在国际通用的 HGVS 命名从 Met 开始计数，写作 c.20A>T（编码区第 20 位 A 变成 T）、p.Glu7Val。两种写法说的是同一个突变，读文献和客户资料时要留意这种"差一位"的情况。
下面是人 β-珠蛋白基因编码区的前 24 个碱基。点击任意碱基选中它，然后替换、删除或在其后插入碱基，观察蛋白质的变化和突变类型判断。也可以直接点预设按钮。
为什么这个致病突变没有被自然选择淘汰？
只携带一个突变拷贝的人（杂合子）一般不发病，而且对重症疟疾有较强的抵抗力。所以在疟疾流行的地区，这个突变反而带来生存优势，频率较高。这是"同一个突变的利弊取决于环境"的经典例子。
2023 年底，英国和美国先后批准了基于 CRISPR 基因编辑的疗法 Casgevy 用于治疗镰刀型细胞贫血症。有意思的是，它并不直接修复 HBB 突变，而是编辑患者造血干细胞中 BCL11A 基因的一个红系增强子，让本该在出生后关闭的胎儿血红蛋白重新表达，替代有缺陷的成人血红蛋白。这正好用到了第 09 节"增强子"的知识。
并非所有突变都在编码区。启动子上的突变可能让基因表达过高或过低；内含子边界 GT…AG 上的突变可能打乱剪接，让外显子被跳过或内含子被保留。另一个整码缺失的著名例子是囊性纤维化最常见的突变 F508del：CFTR 基因缺失 3 个碱基，导致蛋白第 508 位的苯丙氨酸丢失，蛋白折叠异常。
突变从哪里来，细胞怎样修复
突变的来源大致分为两类：细胞自身"出错"造成的自发突变，以及外界因素（诱变剂）造成的诱发突变。
| 来源 | 怎样损伤 DNA | 主要的修复方式 |
|---|---|---|
| 复制错误 | DNA 聚合酶偶尔放错碱基，校对也没发现（第 04 节） | 错配修复：复制后扫描新链，切掉配错的一段再重新合成 |
| 自发的化学损伤 | 碱基在体温下也会慢慢发生变化，例如胞嘧啶脱去氨基变成尿嘧啶，或碱基脱落留下空位 | 碱基切除修复：认出并切掉单个受损碱基，再补上正确的 |
| 化学诱变剂 | 某些化学物质（如香烟烟雾中的部分成分、实验室用的 EMS 等）会修饰碱基，使它在复制时配错对 | 碱基切除修复、核苷酸切除修复等 |
| 紫外线 | 让同一条链上相邻的两个胸腺嘧啶连在一起，形成胸腺嘧啶二聚体，使 DNA 变形 | 核苷酸切除修复：把包含损伤的一小段单链整段切掉，以另一条链为模板补回 |
| 电离辐射（X 射线、γ 射线） | 能打断 DNA 链，严重时造成两条链同时断开（双链断裂） | 非同源末端连接（直接把断端接上，快但容易多出或丢掉几个碱基）；同源重组（以另一份同源序列为模板精确修复） |
修复系统非常高效，但不可能百分之百修好，漏网的损伤在下一次复制时就被"固定"成突变。突变如果发生在精子或卵子中，可以遗传给后代（生殖细胞突变）；发生在身体其他细胞中，只影响这个细胞和它分裂出的后代（体细胞突变），不会遗传，但体细胞突变的积累是癌症的重要原因。
SNP：人与人之间的常见差异
任意两个人的基因组序列约有 99.9% 相同，差异中最常见的一类是 SNP（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）：基因组某个位置上的单个碱基在人群中有两种或几种常见版本，例如有人是 A、有人是 G。习惯上，在人群中有一定比例（常用 1% 以上）的人携带的单碱基差异才叫 SNP；罕见的、新出现的单碱基改变一般直接叫突变或变异。人类基因组中已登记的 SNP 数以百万计，绝大多数位于非编码区，对性状没有明显影响。
SNP 的意义在于"标记"：有些 SNP 本身改变了蛋白或基因表达，直接影响性状或疾病风险；更多的 SNP 只是与附近的致病变异一起遗传，可以当作路标。基因分型、亲缘鉴定、全基因组关联研究（寻找与疾病相关的位点），以及"药物基因组学"（某些 SNP 影响药物代谢，从而影响剂量和疗效）都建立在 SNP 之上。
在工作中"制造"突变
突变也不总是坏事。它是进化的原材料；我们的免疫系统甚至会在 B 细胞中主动让抗体可变区高频突变，再筛选出亲和力更高的抗体（亲和力成熟，M6 详讲）。实验室和生物技术公司则是人为、有目标地制造突变：
定点突变
在指定位置把一个密码子换成另一个，例如"把第 123 位的丝氨酸突变成丙氨酸"，用来研究某个氨基酸的作用、去掉一个修饰位点或改善稳定性。本质是设计好的错义突变。
突变文库
一次制造成千上万种突变体的混合物。可以在选定位置让密码子覆盖全部 20 种氨基酸（"饱和突变"，常用 NNK 简并密码子，N 代表任意碱基，K 代表 G 或 T），也可以在整个基因上随机引入突变。
定向进化
"制造突变文库 → 筛选表现最好的 → 以它为起点再突变"，反复几轮，在试管里模拟自然选择，用来改造酶的活性、稳定性等。
抗体优化
在抗体可变区（尤其是直接接触抗原的区域）构建突变文库，再通过展示技术筛选亲和力更高、稳定性更好的突变体，是体外版的"亲和力成熟"。
在一个基因编码区靠前的位置缺失了 1 个碱基，最可能的结果是？
本节要点
- 突变是可遗传的 DNA 序列改变，分为替换、插入和缺失；单个碱基的替换叫点突变，分同义、错义、无义三种。
- 插入或缺失非 3 倍数个碱基造成移码，突变点之后的阅读框全部错位；3 的倍数则只多出或少几个氨基酸（如 F508del）。
- 镰刀型细胞贫血症是 HBB 中 GAG→GTG 的错义突变（谷氨酸变缬氨酸），属于隐性遗传病。
- 突变来自复制错误、自发化学损伤、化学诱变剂和辐射（紫外线造成胸腺嘧啶二聚体，电离辐射造成双链断裂），细胞用错配修复、切除修复、双链断裂修复等系统修复。
- SNP 是人群中常见的单碱基差异，用于基因分型、疾病关联研究和药物基因组学。
- 工作中常用定点突变、突变文库、定向进化和抗体优化，有目的地制造突变。
09基因表达调控：开关与音量
你身上几乎每个细胞都有同一套基因组，为什么肝细胞和神经细胞如此不同？
答案是：不是所有基因都一直开着。有些基因维持细胞基本生存，几乎在所有细胞中持续表达，称为管家基因；另一些只在特定细胞、特定时刻表达，例如胰岛素基因主要在胰岛 β 细胞中表达，珠蛋白基因主要在红细胞的前体细胞中表达。决定"哪些基因开、开多大"的过程，叫基因表达调控。中心法则的每一步都可以被调控：
染色质开放程度
DNA 缠得紧，聚合酶就进不去。DNA 甲基化、组蛋白修饰等"表观遗传"标记可以在不改变序列的情况下长期关闭或开启基因。
启动子、转录因子、增强子
启动子决定基础强弱；转录因子是结合特定 DNA 序列的蛋白，激活或抑制转录；增强子能从远处放大转录。
加工、稳定性、翻译
可变剪接、mRNA 降解速度、microRNA 抑制、翻译起始效率等，都会影响最终产出多少蛋白。
修饰与降解
蛋白可能需要切割、磷酸化等修饰才激活，也会被细胞主动降解。
经典模型：大肠杆菌的乳糖操纵子
1961 年，雅各布和莫诺提出了乳糖操纵子模型，首次揭示了基因如何被"开关"控制，两人与利沃夫分享了 1965 年诺贝尔生理学或医学奖。大肠杆菌最喜欢的食物是葡萄糖；只有在葡萄糖缺乏而乳糖存在时，它才需要合成分解乳糖的酶。操纵子是原核生物中由同一个启动子控制、转录成一条 mRNA 的一组基因。乳糖操纵子包括三个结构基因：lacZ（β-半乳糖苷酶，把乳糖分解为葡萄糖和半乳糖）、lacY（通透酶，把乳糖运进细胞）、lacA（转乙酰酶），以及上游的启动子和操纵基因（operator）。
- 刹车（负调控）：附近的 lacI 基因持续产生阻遏蛋白，它结合在操纵基因上，挡住 RNA 聚合酶。乳糖存在时，其异构体异乳糖作为诱导物结合阻遏蛋白，使它变形脱落，刹车松开。
- 油门（正调控）：葡萄糖缺乏时，细胞内 cAMP 水平升高，cAMP 与 CAP 蛋白结合，复合物结合在启动子附近，帮助 RNA 聚合酶高效转录。
切换环境中有没有乳糖（或 IPTG）和葡萄糖，看看阻遏蛋白、CAP 和 RNA 聚合酶如何响应，转录水平如何变化。
简化模型：真实情况中葡萄糖还会通过"诱导物排斥"等机制抑制乳糖进入细胞；"关闭"时也有极低的本底转录。
从乳糖操纵子到 IPTG 诱导表达
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是异乳糖的结构类似物，同样能结合阻遏蛋白、使其脱离操纵基因，但它不会被 β-半乳糖苷酶分解，加入培养基后浓度保持稳定，能持续诱导。实验室常用的终浓度大约在 0.1–1 mM 范围。
大肠杆菌最常用的 pET 表达系统巧妙地利用了这一点（M4、M5 会展开）：目标基因放在 pET 载体上 T7 噬菌体启动子的下游，大肠杆菌自己的 RNA 聚合酶几乎不识别这个启动子；表达菌株如 BL21(DE3) 的染色体上带有 T7 RNA 聚合酶基因，而这个基因受 lac 系统控制。加入 IPTG → 阻遏蛋白脱落 → 细菌合成 T7 RNA 聚合酶 → T7 RNA 聚合酶大量转录目标基因 → 大量表达目标蛋白。不加 IPTG 时，目标蛋白基本不表达，这让细菌可以先长到足够多再"开工"，对可能毒害细菌的蛋白尤其重要。
| 启动子 | 用于哪种宿主 | 特点 |
|---|---|---|
| T7 | 大肠杆菌（需宿主提供 T7 RNA 聚合酶） | 极强，配合 IPTG 诱导，pET 系统的核心 |
| lac / tac | 大肠杆菌 | 受 lac 阻遏蛋白控制，IPTG 诱导 |
| AOX1 | 毕赤酵母 | 甲醇诱导，可实现高水平表达 |
| 多角体蛋白启动子 | 昆虫细胞（杆状病毒系统） | 病毒感染后期极强表达 |
| CMV、EF1α | 哺乳动物细胞（如 CHO、HEK293） | 持续表达，CMV 是瞬时表达最常用的强启动子之一 |
真核细胞的调控工具箱
真核细胞没有乳糖操纵子这样"几个基因共用一个开关"的结构，每个基因都有自己的调控序列，调控手段也更多层次。下面是最重要的四类。
① 转录因子、增强子与沉默子
转录因子（transcription factor）是一类能识别并结合特定短 DNA 序列的蛋白质。有的帮助招募 RNA 聚合酶、促进转录（激活因子），有的阻碍转录（抑制因子）。它们结合的位置除了启动子附近，还可以是远处的调控序列：增强子（enhancer）结合激活因子后，DNA 弯折成环，把它们带到启动子旁边，放大转录，增强子可以位于基因上游、下游甚至内含子里，距离可达数千到数万碱基；沉默子（silencer）则结合抑制因子，压低转录。一个基因往往受多个增强子和多种转录因子共同控制，像一块需要多把钥匙同时转动的锁。
② 表观遗传：不改序列的"书签"
表观遗传（epigenetics）指不改变 DNA 序列、却能影响基因表达、而且能随细胞分裂传给子细胞的调控方式。两种最主要的标记是：
- DNA 甲基化：在 DNA 上的胞嘧啶（主要是紧跟着 G 的 C，即"CpG"位置）加上一个甲基。启动子区域的 CpG 被大量甲基化时，转录因子难以结合，基因通常被关闭。
- 组蛋白修饰：给组蛋白的"尾巴"加上乙酰基、甲基等化学基团。一般来说，组蛋白乙酰化让染色质变松散、基因更容易被读取；某些位点的甲基化则让染色质收紧、基因关闭（另一些位点的甲基化反而与激活有关）。
可以把基因组想象成一本书：DNA 序列是文字，表观遗传标记是夹在书里的书签和贴在某些页上的封条，决定哪些页常被翻开、哪些页被封起来。
③ RNA 干扰：让 mRNA "未读先毁"
RNA 干扰（RNAi）是用一段小 RNA 按碱基配对"找到"目标 mRNA，再让它被降解或无法翻译的机制。小 RNA 会被装进一个叫 RISC 的蛋白复合物中，由它执行切割或抑制。1998 年法尔和梅洛发现了这一现象，2006 年获得诺贝尔生理学或医学奖。参与 RNA 干扰的小 RNA 主要有两类：
| miRNA（微 RNA） | siRNA（小干扰 RNA） | |
|---|---|---|
| 来源 | 细胞自己的基因编码，是天然的调控分子 | 来自外源的双链 RNA，实验和药物中通常人工设计合成 |
| 长度 | 约 22 个核苷酸 | 约 21 个核苷酸（双链） |
| 与目标的配对 | 常常只部分互补，多结合在 mRNA 的 3'UTR，一个 miRNA 可同时调节许多基因 | 与目标 mRNA 完全互补，特异性高 |
| 主要效果 | 抑制翻译、促进 mRNA 降解，起"调低音量"的作用 | 引导 RISC 切断目标 mRNA，使它被降解，起"关掉"的作用 |
RNA 干扰作用在中心法则的"mRNA → 蛋白质"这一环：不改变 DNA，而是在 mRNA 层面减少某个蛋白的产量，所以常被称为"基因敲低"（区别于在 DNA 层面彻底破坏基因的"敲除"）。2018 年，首个 siRNA 药物获得美国 FDA 批准，用于治疗一种由异常蛋白在体内沉积引起的遗传病，核酸药物在 M7 详讲。
④ 组织特异性表达：同样的 DNA，不同的细胞
回到本节开头的问题。你的肝细胞和神经细胞含有几乎完全相同的 DNA，差别在于每种细胞里有哪些转录因子、哪些染色质区域是开放的。在胚胎发育过程中，细胞逐步打开一部分基因、用表观遗传标记长期封存另一部分，最终形成稳定的身份：肝细胞大量表达白蛋白，胰岛 β 细胞表达胰岛素，红细胞的前体表达珠蛋白。这就是组织特异性表达。基因治疗中常利用这一点，选用只在目标组织中活跃的启动子，让治疗基因只在需要的地方表达。
本节要点
- 同一个体的细胞含有几乎相同的 DNA，差别来自基因表达调控；中心法则的每一步都可被调控，转录是最主要的关口。
- 乳糖操纵子：阻遏蛋白结合操纵基因"踩刹车"，异乳糖或 IPTG 结合阻遏蛋白使其脱落；葡萄糖缺乏时 cAMP–CAP"踩油门"。
- IPTG 不会被分解、能持续诱导；pET 系统中 IPTG 解除对 T7 RNA 聚合酶基因的抑制，进而大量转录目标基因。
- 真核细胞靠转录因子结合启动子、增强子（放大）和沉默子（压低）调控转录。
- 表观遗传不改变序列：启动子 DNA 甲基化通常关闭基因，组蛋白乙酰化通常让染色质松散、基因活跃。
- RNA 干扰在 mRNA 层面减少蛋白：miRNA 是细胞自身的调控小 RNA，siRNA 与目标 mRNA 完全互补并引导其被切割。
10联系工作①：密码子优化
同一个蛋白，换一种"写法"，表达量可能大不相同。
第 06 节讲过，除了 Met 和 Trp，每种氨基酸都有多个同义密码子。但不同物种对同义密码子的使用频率差别很大，这叫密码子偏好。一个重要原因是细胞中各种 tRNA 的含量不同：常用密码子对应的 tRNA 多，翻译快；少用密码子（稀有密码子）对应的 tRNA 少，核糖体可能在这里"等料"停顿。
例如，精氨酸有 6 个密码子，在人类基因中 AGA、AGG 相当常见，但在大肠杆菌中它们的使用频率很低，属于典型的稀有密码子；AUA（Ile）、CUA（Leu）、CCC（Pro）、GGA（Gly）等也常被列为大肠杆菌的稀有密码子。把一个人类基因原封不动放进大肠杆菌，如果其中稀有密码子多，尤其是几个连在一起，就可能导致翻译停滞、提前终止或错误掺入氨基酸，表达量很低。一些商业化表达菌株会额外补充这些稀有 tRNA，另一个更彻底的办法就是从序列上解决问题。
密码子优化就是在不改变氨基酸序列的前提下，重新选择同义密码子，让 DNA 更适合在目标宿主中表达。实际的优化算法会综合考虑多个因素：
密码子使用频率
尽量使用宿主常用的密码子，常用"密码子适应指数（CAI）"等指标衡量。但并非简单地全部换成最常用的那一个，那样可能耗尽某种 tRNA 并制造重复序列。
GC 含量
整体和局部的 GC 含量都不宜过高或过低。GC 过高的片段难以合成和测序，也容易形成稳定的二级结构。
mRNA 二级结构
尤其是起始密码子附近，过于稳定的发夹结构会妨碍核糖体结合，降低翻译起始效率。
避开"有害序列"
去除后续克隆要用到的酶切位点、长重复和单一碱基长串；在真核表达中避开潜在的剪接位点和提前出现的加尾信号（如 AATAAA）；在大肠杆菌中避免编码区内出现类似 SD 的序列。
几个关键指标和概念
CAI（密码子适应指数，codon adaptation index）衡量一段编码序列的密码子用法和宿主"高表达基因"的用法有多接近。它的取值在 0 到 1 之间：每个位置如果用的都是宿主高表达基因里最常用的那个同义密码子，CAI 就是 1；用的稀有密码子越多，CAI 越低。CAI 高通常意味着翻译更顺畅，但它只是参考指标之一，不是越接近 1 越好。
GC 含量是序列中 G 和 C 占全部碱基的百分比。G–C 之间有 3 个氢键、A–T 之间只有 2 个（M2），所以 GC 越高，DNA 双链越"粘"、RNA 越容易自身折叠。优化时通常把整体 GC 控制在宿主偏好的中间范围，并消除局部的极端区段。
mRNA 二级结构是单链 mRNA 中互补的片段彼此配对形成的发夹、茎环等结构。核糖体需要把 mRNA 拉直才能读取，结构太稳定会让它"卡住"，在起始密码子附近影响尤其大。
需要避开的序列元件
除了密码子本身，优化时还要扫描并去除一些会在宿主或后续操作中"惹麻烦"的短序列：
| 序列元件 | 为什么要避开 | 主要针对 |
|---|---|---|
| 限制性酶切位点 | 限制性内切酶会在特定的短序列（如 EcoRI 的 GAATTC）处切断 DNA（M4）。如果编码区内部出现了克隆时要用的酶切位点，基因会被切断 | 所有宿主（克隆步骤） |
| 内部剪接位点 | 编码区里偶然出现类似"GT…AG"剪接信号的序列，可能被剪接体误认为内含子而切掉一段，导致蛋白缺失或移码 | 哺乳动物等真核宿主 |
| poly(A) 加尾信号 | 编码区内出现 AATAAA 等加尾信号，可能让 mRNA 提前被切断加尾，得到截短的 mRNA | 真核宿主 |
| 重复序列、同聚物 | 长的重复片段和一长串相同碱基（如 GGGGGGGG）难以准确合成和测序，在细胞内也可能引起重组、丢失 | 基因合成与所有宿主 |
| 内部 SD 样序列 | 编码区中部出现类似 AGGAGG 的序列，可能让核糖体从错误位置起始，或造成翻译停顿 | 大肠杆菌 |
| mRNA 不稳定元件 | 3'UTR 和编码区中富含 AU 的某些序列（如 ATTTA 重复）会促使 mRNA 被快速降解 | 真核宿主 |
为什么"同一个蛋白、不同的 DNA 序列"表达量差很多
把上面的因素串起来，就能理解为什么同样编码一个蛋白，不同写法的 DNA 表达量可能相差数倍甚至更多：
- 翻译起始：起始密码子附近的 mRNA 结构影响核糖体能否顺利结合，这常常是决定产量的第一道关。
- 翻译延伸：稀有密码子对应的 tRNA 少，核糖体在这里等待，连续的稀有密码子还可能导致翻译中止或错误掺入氨基酸。
- mRNA 的寿命：不稳定元件和某些结构会让 mRNA 更快被降解，可供翻译的模板就少。
- 加工错误：在真核细胞里，隐蔽的剪接位点或加尾信号会产生错误的 mRNA。
- 能否顺利拿到 DNA：GC 极端或重复太多的序列，合成、克隆、测序都更困难。
密码子优化就是同时照顾这些因素，在大量可能的同义写法中挑出一条综合最好的。一个 300 个氨基酸的蛋白，可能的同义 DNA 写法是一个天文数字，这正是需要算法而不是人工来做的原因。
输入一段 DNA 编码序列或氨基酸序列，工具会为每个氨基酸选用一个大肠杆菌高频使用的密码子，并自动避开几个常用酶切位点，然后对比优化前后的序列。仅为演示用的简化算法，真实的优化软件要复杂得多。
演示用的"稀有密码子"清单：AGA、AGG、CGG（Arg），AUA（Ile），CUA（Leu），CCC（Pro），GGA（Gly）。检查的酶切位点：EcoRI、BamHI、HindIII、NdeI、XhoI、NotI。
本节要点
- 不同物种偏好使用不同的同义密码子（密码子偏好），一个重要原因是各种 tRNA 的丰度不同；宿主很少使用的叫稀有密码子。
- 密码子优化在同义密码子之间替换，不改变氨基酸序列，目的是让基因更适合在目标宿主中表达，但不保证一定提高表达或活性。
- 优化时综合考虑密码子使用频率（常用 CAI 衡量，0–1）、GC 含量、mRNA 二级结构，而不是简单地全部换成最常用的密码子。
- 需要避开限制性酶切位点、内部剪接位点、poly(A) 信号、重复序列和同聚物、大肠杆菌中的内部 SD 样序列等元件。
- 同一蛋白的不同 DNA 写法会影响翻译起始、延伸、mRNA 稳定性和加工，因此表达量可能差别很大。
11联系工作②：mRNA 技术与服务术语
把中心法则"截一段"拿来用：直接给细胞 mRNA，让细胞自己造蛋白。
按中心法则，蛋白质由 mRNA 翻译而来。那么，与其把基因（DNA）送进细胞再等它转录，不如直接送入 mRNA。这个想法早在 1990 年代就有人尝试，但长期面临两大障碍：外来 RNA 会触发强烈的先天免疫反应，同时 mRNA 本身不稳定、带负电，难以进入细胞。
关键突破一：修饰核苷
卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和德鲁·韦斯曼（Drew Weissman）在 2005 年发表的研究发现：体外转录的 mRNA 会被免疫系统当作"入侵者"识别，而如果把其中的尿苷换成假尿苷等修饰核苷（这类修饰在细胞自身的 tRNA、rRNA 中天然存在），免疫激活就会大大降低，蛋白产量还会提高。后来的研究发现 N1-甲基假尿苷（m1Ψ）效果更好，新冠 mRNA 疫苗（BioNTech/辉瑞和 Moderna 的产品）都用它替换了全部尿苷。两人因"核苷碱基修饰方面的发现，使有效的新冠 mRNA 疫苗得以开发"，获得了 2023 年诺贝尔生理学或医学奖。
关键突破二：脂质纳米颗粒（LNP）递送
LNP 是直径通常不到 100 纳米的脂质小球，一般由四类脂质组成：可电离脂质（在酸性条件下带正电，能包裹带负电的 mRNA，进入细胞后帮助它从内体中释放）、辅助磷脂、胆固醇和 PEG 化脂质。它保护 mRNA 不被降解，并帮助它穿过细胞膜，正好解决了 M1 中讲过的"核酸无法自由穿膜"的问题。
一条疫苗 mRNA 的结构（5' 帽、5'UTR、ORF、3'UTR、poly(A) 尾）和你在第 03 节看到的天然成熟 mRNA 完全对应，每一部分都可以优化。下面按生产顺序逐步说明。
体外转录（IVT）：在试管里完成"转录"
体外转录（in vitro transcription，IVT）就是把第 05 节的转录搬到试管里：给 RNA 聚合酶一段 DNA 模板和四种核苷酸原料（NTP），让它合成大量 mRNA。最常用的是来自 T7 噬菌体的 T7 RNA 聚合酶（也有用 SP6 等其他噬菌体聚合酶的），因为它只有一个亚基、速度快、产量高，而且只从自己的启动子开始转录。T7 启动子是一段约 20 个碱基的短序列（常见写法 TAATACGACTCACTATAG，转录从最后的 G 开始），放在 ORF 上游即可。
| 组成 / 步骤 | 做什么 | 要点 |
|---|---|---|
| DNA 模板 | 提供 mRNA 的序列：T7 启动子 + 5'UTR + ORF + 3'UTR +（可选）poly(A) 编码区 | 可以是线性化的质粒（用限制性内切酶在 poly(A) 下游切开），也可以是 PCR 产物。必须是线性的：聚合酶读到模板末端就"掉下来"，所以每条 mRNA 都在同一位置结束、长度一致 |
| T7 RNA 聚合酶 + NTP | 以模板为模板合成 RNA | 用 N1-甲基假尿苷三磷酸完全替代普通的 UTP，合成出的 mRNA 中所有 U 都变成 m1Ψ |
| 加 5' 帽 | 给 mRNA 装上核糖体识别的"把手"并保护 5' 端 | 两种方式：共转录加帽（反应中加入帽类似物，转录时直接接在 5' 端）；酶法加帽（转录后用加帽酶处理）。天然 mRNA 的帽除了 7-甲基鸟苷，第一个核苷酸的核糖上通常还有一个甲基，叫 Cap 1，只有前者的叫 Cap 0；Cap 1 更像"自己人"的 mRNA，更少引起免疫识别 |
| 加 poly(A) 尾 | 保护 3' 端、促进翻译 | 可以直接编码在模板里（长度确定），也可以转录后用 poly(A) 聚合酶加上（长度不太均一） |
| 去除模板与纯化 | 得到纯的 mRNA | 用 DNA 酶降解 DNA 模板；再去除未反应的原料、酶，以及 IVT 的副产物双链 RNA（dsRNA）。dsRNA 是病毒感染的典型信号，会强烈激活免疫，所以 dsRNA 残留是重要的质控指标 |
| 质控与制剂 | 确认质量，再与脂质混合制成 LNP | 常见检测包括完整性（是否全长）、加帽率、poly(A) 长度、dsRNA 残留、内毒素等 |
为什么修饰核苷能降低免疫原性
人体细胞有一套先天免疫"传感器"（M6 会讲），专门识别病毒等入侵者的 RNA，例如内体中的 Toll 样受体 TLR7/8、细胞质中的 RIG-I 等。它们识别的特征包括：富含未经修饰的尿苷、双链结构、5' 端没有正常的帽。体外转录的普通 mRNA 恰好"看起来像病毒"，会触发干扰素等炎症反应，细胞还会启动防御程序暂停翻译，结果是副作用大、蛋白产量低。
细胞自身的 RNA（尤其是 tRNA、rRNA）天然带有很多修饰核苷，这是"自己人"的标志之一。把 mRNA 里的尿苷换成 N1-甲基假尿苷（m1Ψ）后，这些传感器难以识别它，免疫激活大大降低，翻译也不再被抑制，于是同样剂量的 mRNA 能产出更多蛋白。重要的是，m1Ψ 在翻译时仍按 U 的规则与 A 配对，所以编码的氨基酸序列不变。配合 Cap 1 帽和充分去除 dsRNA，三者一起让 mRNA 更"隐身"。
mRNA 疫苗和药物的原理
mRNA 疫苗：mRNA 编码病原体的一个蛋白（抗原），例如新冠疫苗编码病毒表面的刺突蛋白。LNP 把 mRNA 送进注射部位附近的细胞，细胞按中心法则翻译出这个抗原蛋白，免疫系统"看到"它之后产生抗体和免疫记忆；mRNA 本身几天内就被降解。mRNA 药物的思路相同，只是编码的是治疗用的蛋白，例如补充患者缺失的酶，或编码 Cas9 在体内进行基因编辑。
与蛋白疫苗或 DNA 载体相比，mRNA 的优势是设计和生产快、不进入细胞核；挑战在于稳定性（需要低温保存）、递送效率以及免疫反应的控制。除疫苗外，mRNA 也在蛋白替代疗法、肿瘤疫苗、体内基因编辑（递送编码 Cas9 的 mRNA）等方向被探索。
服务术语对照表
下面这些在金斯瑞基因合成及相关服务中常见的术语，都能在本模块找到原理：
| 常见术语 | 它是什么 | 对应知识点 |
|---|---|---|
| 基因合成 | 不需要模板，按给定序列化学合成 DNA | DNA 就是 A/T/G/C 的序列（第 03 节）；复制与测序验证（第 04、08 节） |
| 密码子优化 | 不改变氨基酸序列，重写为更适合宿主的同义密码子 | 简并性（第 06 节）；密码子偏好（第 10 节） |
| cDNA / cDNA 克隆 | 由 mRNA 逆转录得到、不含内含子的 DNA | 逆转录（第 01 节）；剪接与 cDNA（第 05 节） |
| ORF 克隆 | 只含从起始到终止密码子的开放阅读框的克隆 | 基因结构（第 03 节）；阅读框（第 06 节） |
| 定点突变 / 突变体 | 在指定位置改变碱基，从而改变特定氨基酸 | 错义、无义、移码（第 08 节） |
| 表达载体、启动子、诱导表达 | 让目标基因在宿主中被转录和翻译的"开关"元件 | 启动子与调控、IPTG（第 09 节） |
| mRNA 合成 / IVT 模板 | 以带噬菌体启动子的 DNA 为模板体外转录 mRNA | 转录（第 05 节）；mRNA 技术（本节） |
| 线性化质粒 / PCR 模板 | IVT 用的线性 DNA 模板，保证转录在固定位置结束 | 本节 |
| 加帽（Cap 0 / Cap 1）、加尾 | 给 mRNA 装上 5' 帽和 poly(A) 尾 | mRNA 加工（第 05 节）；本节 |
| 修饰核苷（m1Ψ） | 用 N1-甲基假尿苷替代尿苷，降低免疫原性、提高蛋白产量 | 本节 |
| dsRNA 残留 | IVT 副产物双链 RNA 的含量，会激活免疫，是质控指标 | 本节 |
| LNP 递送 | 把 mRNA 包进脂质纳米颗粒，护送它进入细胞 | 本节；M1 细胞膜 |
用本模块的知识，判断每个情景下最合适的回答。
客户发来一段从基因组数据库下载的人基因序列（包含内含子），想在大肠杆菌中表达这个蛋白。最合适的建议是？
客户的构建是"His 标签 + 目标基因"。测序发现两者连接处少了 1 个碱基，客户问影响大不大？
客户担心："做了密码子优化，我的蛋白会不会变？"正确的回答是？
客户要合成一个用于体外转录 mRNA 的 DNA 模板，ORF 上游必须有什么元件？
本节要点
- mRNA 技术直接把 mRNA 送进细胞，让细胞自己翻译出蛋白；mRNA 在细胞质中工作，不进入细胞核、不整合进基因组。
- 体外转录（IVT）用 T7 RNA 聚合酶，以带 T7 启动子的线性 DNA 模板（线性化质粒或 PCR 产物）合成 mRNA。
- mRNA 需要 5' 帽（共转录加帽或酶法加帽，Cap 1 更像天然 mRNA）和 poly(A) 尾（编码在模板中或酶法添加）。
- 用 N1-甲基假尿苷替代尿苷，能躲开先天免疫传感器、降低免疫原性并提高蛋白产量，而不改变编码的氨基酸。
- 纯化要去除 DNA 模板和双链 RNA 等副产物；LNP 保护 mRNA 并帮助它进入细胞。
- mRNA 疫苗编码抗原蛋白，让细胞产生抗原并引发免疫反应；mRNA 药物编码治疗用蛋白。
12复习：术语卡与模块测验
先用术语卡自测，再完成 14 道测验题。
术语卡片：点击翻面
模块测验
14 道题，答完自动计分，成绩会记录在课程首页。
下列哪个过程由逆转录酶完成？
某隐性遗传病由一个基因的隐性等位基因 a 引起。父母都是不发病的携带者（Aa），他们的孩子患病的概率约是多少？
基因编码链的序列是 5'-ATGGCATGG-3'，对应的 mRNA 是？
梅塞尔森–斯塔尔实验中，¹⁵N 标记的细菌转入 ¹⁴N 培养基繁殖一代后，离心只看到一条中间密度带。这一结果首先排除了哪种假说？
后随链为什么要分成冈崎片段来合成？
下列哪一部分会保留在成熟 mRNA 中，但不会被翻译成氨基酸？
要在大肠杆菌中表达一个人源蛋白，为什么通常使用 cDNA 或只含 CDS 的合成基因，而不是基因组 DNA？
mRNA 序列 5'-AUG UUU UGG UAA-3' 翻译的结果是？
翻译过程中，终止密码子是由什么识别的？
镰刀型细胞贫血症中，β-珠蛋白基因的 GAG 突变为 GTG。这属于哪种突变？
在乳糖操纵子和 pET 表达系统中，加入 IPTG 的直接作用是？
一种 siRNA 药物能降低肝脏中某个致病蛋白的水平。它最可能的作用方式是？
关于密码子优化，下列说法正确的是？
新冠 mRNA 疫苗用 N1-甲基假尿苷（m1Ψ）替换了全部尿苷，主要目的是？
延伸资源
- Khan Academy 生物学："Central dogma (DNA to RNA to protein)"单元，涵盖转录、翻译、遗传密码，有配套练习。
- HHMI BioInteractive：DNA 复制、转录、翻译的分子动画，按真实分子结构制作，是理解复制叉和核糖体工作方式的最佳视觉材料。
- 《基因传：众生之源》（悉达多·穆克吉 著）：从孟德尔到基因编辑的基因发现史，可读性很强，本模块中克里克、尼伦伯格、雅各布与莫诺的故事书中都有。
- 《双螺旋》（詹姆斯·沃森 著）：DNA 结构发现的亲历记，了解科学发现背后的竞争与人性。
- NCBI ORFfinder 与 GenBank 记录：在 NCBI 网站上打开任意一个
NM_开头的 mRNA 记录，找到它的 CDS 坐标，再用本页的翻译器核对蛋白序列。 - 工作练习：找一份基因合成或表达项目的序列文件，标出启动子、起始密码子、标签、终止密码子，并判断它们是否在同一阅读框中。
学完了吗？
回到"学习目标"逐条检查，都能做到就标记完成吧。