M5 蛋白质：结构、表达与纯化

本模块你将学会

这是课程里内容最"硬"的模块之一。学完后，回到这里逐条检查。

• 用氨基酸的性质解释蛋白如何折叠，会用"每个氨基酸约 110 Da"估算分子量，理解等电点与蛋白电荷的关系
• 说清蛋白质一级到四级结构分别是什么、维持每一级结构的作用力，知道结构域的概念和三类结构解析方法
• 理解蛋白质如何折叠、为什么会变性和聚集，为什么大肠杆菌高表达常形成包涵体，复性难在哪里
• 认识糖基化、磷酸化、二硫键、蛋白酶切割、乙酰化等翻译后修饰，说明它们如何影响药效、免疫原性和表达系统的选择
• 讲清重组蛋白表达的流程，比较六类表达系统，区分可溶表达、包涵体与分泌表达、瞬时转染与稳定细胞株，知道融合标签的用途
• 掌握细胞破碎、四类层析（亲和、离子交换、疏水、分子排阻）和超滤换液的原理，能推断洗脱顺序、设计典型纯化路线
• 会读 SDS-PAGE 胶图、用 A280 计算浓度、计算纯度与收率，知道内毒素和 K_D 的含义
• 知道蛋白该怎么保存，区分化学合成多肽与重组蛋白，并能用这些知识理解客户的常见问题

01回顾：氨基酸、肽键与"干活的分子"

M2 认识了氨基酸，M3 看到了核糖体如何把它们连起来。先快速复习，再回答：为什么生命中大部分"活儿"都交给了蛋白质？

蛋白质是由氨基酸连成的长链。每个氨基酸都有相同的"骨架"：一个中心碳原子（α 碳）连着一个氨基（–NH₂）、一个羧基（–COOH）、一个氢原子，以及一个可变的侧链（R 基团）。组成蛋白质的标准氨基酸有 20 种，它们的区别只在侧链。

一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基脱去一分子水，形成肽键。这样一个接一个连下去就得到多肽链。链的一端留着游离氨基，称为 N 端；另一端留着游离羧基，称为 C 端。核糖体总是从 N 端向 C 端合成蛋白，所以序列也习惯从 N 端写到 C 端，例如 MKTAYIAK…（单字母缩写，M 是甲硫氨酸，几乎所有蛋白都以它开头）。

侧链决定氨基酸的"性格"

氨基酸的性质如何决定折叠

一条肽链在水里会自己"缩"成特定的形状，背后就是这些侧链的性格在起作用。记住三条最基本的规律，后面讲折叠、变性和纯化时都会反复用到：

• 疏水的往里藏：疏水侧链不愿意接触水，会聚到分子内部，形成疏水核心。这是可溶蛋白折叠最主要的推动力。如果折叠出错，疏水侧链暴露在表面，蛋白之间就容易互相粘在一起（聚集）。
• 带电的留在表面：带电和极性侧链喜欢水，多分布在表面，让蛋白能溶在水里。带相反电荷的侧链相互吸引，可形成离子键（盐桥）；同种电荷相互排斥，让蛋白分子之间不容易挤成一团。蛋白整体带多少电，取决于溶液的 pH（见下面的等电点）。
• 半胱氨酸成对"钉"住结构：两个半胱氨酸侧链上的巯基（–SH）可以氧化成一个 二硫键（–S–S–），这是侧链之间唯一常见的共价键，像订书钉一样把肽链上相隔很远的两处固定在一起。分泌到细胞外的蛋白（如抗体、细胞因子）常富含二硫键。

等电点（pI）：蛋白带什么电？

蛋白质带电，来自两类基团：酸性侧链（天冬氨酸、谷氨酸）在中性溶液里会失去 H⁺，带负电；碱性侧链（赖氨酸、精氨酸，以及部分组氨酸）会结合 H⁺，带正电；此外链两端的氨基和羧基也贡献一点电荷。溶液越酸（pH 越低，H⁺ 越多），这些基团越倾向于结合 H⁺，蛋白越偏正电；溶液越碱，越偏负电。

总有一个 pH，让蛋白上的正、负电荷恰好抵消、净电荷为零，这个 pH 就叫等电点（pI）。规律只有一条：pH 低于 pI，蛋白净带正电；pH 高于 pI，蛋白净带负电。酸性氨基酸多的蛋白 pI 低（偏酸），碱性氨基酸多的蛋白 pI 高（例如蛋清溶菌酶的 pI 约为 11）。pI 可以根据序列用 ExPASy ProtParam 等工具估算。

为什么 pI 在工作中很重要？第一，在 pH 接近 pI 时，蛋白分子之间缺少同种电荷的排斥，溶解度最低、最容易沉淀，所以缓冲液的 pH 一般要避开 pI；第二，离子交换层析正是利用"选一个 pH 让目标蛋白带上某种电荷"来抓住它（第 06 节详讲）。

为什么蛋白质是"干活的分子"？

如果说 DNA 是图纸，那么蛋白质就是按图纸造出来的机器和零件。DNA 化学上很"单调"（只有 4 种碱基，主要任务是稳定地储存信息），而蛋白质有 20 种性格各异的积木，可以组合出几乎无穷的序列：一条 100 个氨基酸的链，理论上就有 20¹⁰⁰ 种可能。不同序列折叠成不同的三维形状，形状再决定功能。正因如此，从催化反应到搬运氧气、从传递信号到识别病原体，几乎所有生命活动都由蛋白质直接完成。

均为教科书或公开数据库的常用近似值。一个基因可以通过可变剪接等方式产生多种蛋白，所以人体蛋白种类远多于 2 万。

分子量：用长度快速估算

蛋白的大小用分子量表示，单位是道尔顿（Da）：1 Da 约等于一个氢原子的质量。水分子约 18 Da，葡萄糖约 180 Da；蛋白很大，所以习惯用 kDa（千道尔顿，1 kDa = 1000 Da），例如一个 IgG 抗体约 150 kDa。各种氨基酸轻重不一，但连进肽链后（每形成一个肽键脱去一分子水），平均每个氨基酸残基约 110 Da。所以：

分子量（Da）≈ 氨基酸数 × 110

02蛋白质结构的四个层级

一条线如何变成一台精密机器：从序列到局部结构，再到整体折叠和多亚基组装。

生物化学家把蛋白质结构分成四个层级。这种划分不仅是为了好记，更重要的是：每一级由不同的化学作用维持，也会被不同的条件破坏。理解这一点，后面的变性、复性、还原/非还原电泳、纯化条件就都顺理成章了。

四个层级逐一看

一级结构就是氨基酸的排列顺序，相邻氨基酸由肽键（共价键）连接。它直接由基因的 DNA 序列决定，是其余各级结构的"源代码"：蛋白最终折成什么形状，原则上都写在这条序列里。哪怕只换掉一个氨基酸，也可能改变整个蛋白的命运（见下文镰刀型贫血）。

二级结构是主链在局部折成的规则形状，最常见的有两种。α 螺旋（α-helix）像一根右旋的弹簧，每圈约 3.6 个氨基酸，第 i 个氨基酸主链上的 C=O 与第 i+4 个氨基酸主链上的 N–H 形成氢键，侧链朝螺旋外侧伸出。β 折叠（β-sheet）由几段伸展的肽链并排排列，相邻链之间的主链 C=O 与 N–H 形成氢键，组成一张"褶皱的片"；相邻链的走向可以相同（平行）或相反（反平行）。连接这些规则结构的不规则片段叫环区（loop），通常较灵活。关键是：二级结构靠主链原子之间的氢键维持，与侧链是什么关系不大。

三级结构是整条肽链在三维空间中的完整形状，由侧链之间的各种作用共同维持：疏水作用（疏水侧链聚成内部核心，是最主要的驱动力）、氢键、带相反电荷侧链之间的离子键（盐桥）、原子紧密接触时的范德华力，以及共价的二硫键。同一条链上相距很远的两个半胱氨酸，折叠后在空间上靠近，就能形成二硫键，把这两处"钉"在一起。

四级结构是两条或更多条肽链（每条叫一个亚基）组装成的复合体，维持力与三级结构相同，有时还有链间二硫键。血红蛋白由 2 条 α 链和 2 条 β 链组成，每个亚基带一个能结合氧的血红素；IgG 抗体由 2 条相同的重链和 2 条相同的轻链通过二硫键连成 Y 形，总分子量约 150 kDa。抗体两条"臂"的顶端是可变区（不同抗体的序列在这里差别最大，构成抗原结合位点），其余部分是序列相对固定的恒定区；Y 形的"柄"叫 Fc 区，由两条重链的恒定区组成（M6 详讲）。并非所有蛋白都有四级结构：只由一条链构成的蛋白最高到三级。

结构域：蛋白里的"功能模块"

较大的蛋白往往不是一整团，而是由几个结构域（domain）拼成的。结构域是一段能各自独立折叠、通常也承担某项特定功能的区域，一般有几十到两三百个氨基酸，结构域之间由较灵活的连接区相连，就像几个功能模块串在一根绳子上。例如：

• 抗体：每条轻链由 2 个结构域组成，每条重链由 4 个结构域组成（IgG），它们都属于同一种折叠方式，叫"免疫球蛋白结构域"。
• 细胞表面受体：常由伸在细胞外、负责结合信号分子的胞外结构域，穿过细胞膜的跨膜区，以及在细胞内传递信号的胞内结构域（有时是一个激酶结构域）组成。

有些蛋白还含有天然无序区：本身就没有固定形状的柔性片段。因为结构域能独立折叠，研究者常常只表达需要的那一个或几个结构域（称为截短体），而不表达全长蛋白：全长蛋白可能难表达、易降解，跨膜区疏水难溶，无序区又会妨碍结晶。

结构决定功能

蛋白质能"干活"，靠的是形状和表面化学性质的精确匹配。酶的活性中心是一个形状和电荷都与底物契合的"口袋"；抗体顶端的结合位点与抗原表面像锁和钥匙一样互补；血红蛋白的四个亚基会"互相通气"——一个亚基结合氧后，其余亚基更容易结合氧（协同效应），让它在肺里高效装氧、在组织里高效卸氧。反过来，形状一旦被破坏，功能也就随之消失。

怎么"看到"蛋白的结构：三种实验方法和 AlphaFold

蛋白太小，光学显微镜看不见它的形状。要知道原子级的三维结构，主要有三种实验方法，外加近年兴起的计算预测。它们都只要求理解概念：

传统实验方法往往要花数月甚至数年。蛋白质数据库（PDB）自 1971 年建立以来，累计收录了二十多万个实验测定的结构，而已知的蛋白序列数以亿计。既然安芬森证明了"序列决定结构"（第 03 节），能不能只凭序列算出结构？这个问题困扰了生物学界约半个世纪。

2020 年，DeepMind 公司的 AlphaFold2 在两年一届的蛋白结构预测竞赛 CASP14 中，对许多蛋白的预测精度接近实验测定水平。随后公开的 AlphaFold 蛋白结构数据库已收录超过 2 亿个预测结构，几乎覆盖了所有已知蛋白序列。

03折叠与错误折叠

折叠对了才能干活；折叠错了，轻则失活，重则聚集致病。这也是重组蛋白生产中最常见的"坑"。

一条新合成的肽链如何在极短时间内找到唯一正确的形状？1960 年代，安芬森（Christian Anfinsen）用尿素和还原剂把核糖核酸酶 A 彻底"打散"（变性，二硫键也被打开），再慢慢去掉这些试剂，酶又自己折叠回去，并恢复了活性。结论是：折叠所需的信息就写在一级序列里。他因此分享了 1972 年诺贝尔化学奖。

疏水核心：折叠的主要动力

细胞内是水的环境。疏水侧链就像混在水里的油滴，会自发地聚到一起、躲进蛋白内部，形成疏水核心；亲水和带电的侧链则留在表面与水接触。这种"内油外水"的格局是绝大多数可溶蛋白的基本构造。膜蛋白恰好相反：插在细胞膜里的那一段，外表面是疏水的，才能"泡"在磷脂的尾巴中间——这也是膜蛋白离开细胞膜后难以保持稳定、难表达难纯化的根本原因。

分子伴侣：折叠的"助手"

细胞内部非常拥挤，蛋白浓度极高。新生肽链在折好之前，疏水部分暴露在外，很容易和别的链粘在一起。分子伴侣（chaperone）会结合这些暴露的疏水区，防止乱粘，并给它们反复尝试折叠的机会。很多伴侣在高温等应激条件下大量表达，因此也叫热休克蛋白（Hsp），例如 Hsp70；大肠杆菌的 GroEL/GroES 像一个带盖的"折叠小屋"，把肽链关在里面安静地折叠。内质网里也有自己的伴侣（如 BiP），以及帮助二硫键正确配对的蛋白二硫键异构酶（PDI）。

分子伴侣只是"帮忙"，并不提供结构信息，这与安芬森的结论并不矛盾。实在折不好的蛋白，会被细胞贴上泛素标签，送进蛋白酶体降解——这是细胞的"质量控制"系统。

变性：结构被破坏

维持高级结构的作用力大多是较弱的非共价作用，外界条件稍有改变，结构就可能被破坏，这叫变性。变性一般不切断肽键（一级结构不变），但二、三、四级结构被破坏，功能随之丧失。有些变性是可逆的（去掉变性因素后能重新折叠），很多则因为发生聚集而不可逆。常见的变性因素有六类：

下面的标签页给出每类因素更多的例子：

包涵体：重组表达中最常见的错误折叠

在大肠杆菌里大量表达外源蛋白（尤其是人源蛋白）时，经常发现目标蛋白不在可溶部分，而是聚成一团团致密的不溶颗粒，这就是包涵体（inclusion body）。它本质上是大量错误折叠、互相粘连的目标蛋白。为什么大肠杆菌高表达特别容易形成包涵体？

• 合成太快、太多：强启动子加诱导后，目标蛋白在短时间内大量合成，分子伴侣"忙不过来"，未折好的肽链浓度很高，暴露的疏水区彼此粘连。
• 缺少二硫键形成条件：大肠杆菌的细胞质是还原环境，二硫键很难形成，依赖二硫键的蛋白（如抗体片段、细胞因子）折不好。
• 缺少真核细胞的"配套设施"：没有内质网和真核分子伴侣，也不能糖基化，有些人源蛋白离开这些条件就难以正确折叠。

包涵体也有好处：表达量高，成分以目标蛋白为主（相对较纯），而且聚在一起不容易被蛋白酶降解。要从包涵体得到有活性的蛋白，就要做复性（refolding）：

1. 洗涤：破菌离心后得到包涵体沉淀，用含少量去垢剂的缓冲液洗去膜碎片和杂蛋白；
2. 变性溶解：用约 8 M 尿素或约 6 M 盐酸胍把蛋白完全展开溶解，通常同时加还原剂打开错配的二硫键；
3. 去除变性剂、重新折叠：通过稀释、透析（把样品装进只允许小分子通过的半透膜袋，泡在新缓冲液里，第 06 节详讲）或在层析柱上逐步降低变性剂浓度，让蛋白慢慢折回去；有二硫键的蛋白还要加入还原型和氧化型谷胱甘肽等"氧化还原对"，帮助二硫键正确配对；
4. 验证：纯化后检测是否单体、结构和活性是否恢复。

聚集与疾病

错误折叠的蛋白如果逃过了细胞的质量控制，就可能相互粘连形成聚集体。其中一种特别稳定的有序聚集叫淀粉样纤维，由大量 β 折叠层层堆叠而成，很难被降解。多种神经退行性疾病都与特定蛋白的错误折叠和聚集有关：

04翻译后修饰：出厂前的"精加工"

核糖体"下线"的只是毛坯。很多蛋白还要经过加工，才能具备正确的结构、活性和去向。

翻译后修饰（PTM）是指肽链合成之后，在特定氨基酸上连接化学基团或糖链，或者把链切开、交联。已发现的修饰类型有上百种。它们像给零件喷漆、装配、贴标签，决定着蛋白的稳定性、活性、在体内能存在多久以及被送到哪里。对重组蛋白来说，最关键的问题是：你选的宿主细胞，会不会做你的蛋白需要的那些修饰？

点完图后，用下面这张表把七种最常见的修饰汇总一遍（表中内容都会用到）：

糖基化：最重要、也最复杂的修饰

糖基化是在蛋白上连接糖链。人体内大部分分泌蛋白和膜蛋白都是糖蛋白，抗体、EPO 以及许多受体和细胞因子都带有糖链。糖基化分两大类：N-连接（糖链连在天冬酰胺上，从内质网开始、在高尔基体中加工）和 O-连接（糖链连在丝氨酸或苏氨酸上，主要在高尔基体中添加）。因为糖链是在内质网和高尔基体里装配的，只有具备这些细胞器的真核细胞才能做糖基化，细菌不能。

糖基化有两个让人头疼的特点。第一，不均一：同一种蛋白的不同分子，糖链的长短和组成往往不完全一样，形成多种"糖型"。第二，宿主依赖：同一个基因放进不同的宿主，长出来的糖链差别很大：

• 大肠杆菌：天然不做糖基化，表达出来的是"裸"蛋白。
• 酵母：能做 N-糖基化，但糖链以高甘露糖型为主（酿酒酵母有时会加上很长的甘露糖链），与人的糖型差别较大。
• 昆虫细胞：糖链较短、较简单，通常缺少末端的半乳糖和唾液酸。
• 哺乳动物细胞（CHO、HEK293）：能加工出含半乳糖、唾液酸的复杂型糖链，最接近人，但不同细胞株之间仍有细微差别。

为什么修饰会影响药效和免疫原性

对科研试剂来说，修饰影响活性和实验结果；对蛋白药物来说，修饰直接关系到疗效和安全性，是要严格控制的质量属性：

• 影响在体内能存在多久：糖链末端的唾液酸能减缓蛋白从血液中被清除；缺少唾液酸、末端糖暴露的蛋白会被肝脏等器官的受体识别后更快清除。高甘露糖型糖链也容易被体内的甘露糖受体识别而加速清除。
• 影响功能：抗体 Fc 区糖链的组成会改变抗体招募免疫细胞杀伤靶细胞的能力，例如去掉核心岩藻糖可增强 ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，M6 详讲）；需要磷酸化或前体切割才能激活的蛋白，修饰不对就没有活性。
• 影响折叠和稳定性：有些蛋白需要糖链帮助折叠或保持溶解，去掉糖链后容易聚集；二硫键配错则结构不对。
• 影响免疫原性：免疫原性是指药物引起人体免疫反应、产生抗药抗体的倾向。人体内没有的"非人"糖结构（例如酵母的高甘露糖型糖链，或某些非人哺乳动物细胞产生的特殊糖结构）可能被免疫系统当作异物，导致疗效下降甚至过敏反应。

例子：胰岛素是怎么"剪"出来的

有意思的是，切下来的 C 肽会和胰岛素等量释放进血液，所以医生可以通过测 C 肽来评估患者自身还能分泌多少胰岛素（注射的胰岛素不含 C 肽）。这个例子说明：蛋白的"成熟形式"可能和基因直接编码的序列很不一样，做表达设计时必须清楚自己要的是哪一种形式。

为什么修饰决定了表达系统

定性比较，具体情况因蛋白和工程改造而异。例如已有经过糖基化途径改造的酵母和昆虫细胞株，能产生更接近人的糖型。

05重组蛋白表达：让细胞替你生产蛋白

把一个基因变成一管蛋白——这是蛋白服务的核心流程。

重组蛋白是指把编码目标蛋白的基因（通常经过人工设计和合成）放进一个"宿主"细胞，借用宿主的转录和翻译机器把蛋白生产出来。1982 年，用大肠杆菌生产的重组人胰岛素获批上市，成为第一个利用重组 DNA 技术生产的药物。今天的抗体药、酶制剂、疫苗抗原和大量科研试剂蛋白，都来自这一技术。

逐步看一下每一步在做什么：

• 设计：确定表达全长还是某个结构域（第 02 节）、要不要信号肽（第 04 节）、加什么标签放在哪一端，选好表达系统，并做密码子优化。密码子优化来自 M3 的知识：同一种氨基酸往往有多个同义密码子，不同生物偏好使用不同的密码子；把序列改写成宿主偏好的密码子，氨基酸序列不变，但往往能提高表达量。
• 构建：合成基因，用 M4 的克隆技术装进表达载体（带有启动子等表达元件的质粒），测序确认无误。
• 表达：把载体导入宿主。细菌和酵母吸收外源 DNA 叫转化；把 DNA 送进哺乳动物或昆虫细胞叫转染。然后培养细胞、启动表达。以大肠杆菌为例，常用 T7 启动子系统：细菌长到合适密度后加入诱导剂 IPTG，宿主才开始大量转录、翻译目标基因。一般先在几毫升到几十毫升的小规模下摸索条件（温度、诱导剂浓度、时间），确认能表达、可溶，再放大到升级规模。
• 纯化与检测：分别在第 06、07 节详讲。

表达形式：可溶还是包涵体？胞内还是分泌？

大肠杆菌的周质空间是它内膜和外膜之间的一层空间，环境是氧化性的，二硫键比在细胞质里容易形成；在目标蛋白前加上细菌的信号肽，就能把它送到那里。

影响表达量和可溶性的因素

同一个蛋白，换一种设计或条件，表达量可能差几十倍。最常被调整的因素有：

当客户说"表达出来全是包涵体"时，常见的应对思路大致按从易到难排列：

1. 放慢速度：降低诱导温度（如 16–25 °C）、降低诱导剂浓度；
2. 加"助溶"标签：在目标蛋白前融合 MBP、SUMO、硫氧还蛋白（Trx）、GST 等本身可溶性很好的蛋白，带着目标蛋白一起溶解（见下文"融合标签"）；
3. 增加帮手：共表达分子伴侣；换用有利于二硫键形成的改造菌株，或把蛋白分泌到氧化性的周质空间；
4. 调整构建：截短到可溶的结构域，去掉疏水的跨膜区；
5. 接受包涵体：变性溶解后复性（第 03 节），或者用于不需要天然构象的用途（例如部分抗原免疫）；
6. 换宿主：改用酵母、昆虫或哺乳动物细胞。

六类表达系统对比

选表达系统，本质上是在修饰能力、产量、成本、周期之间权衡。下表列出最常用的六类：

周期和产量都只是常见量级，实际差异巨大，取决于具体蛋白、构建和工艺优化，不能作为项目承诺。

无细胞表达（cell-free expression）不用活细胞：把细胞打碎后提取出核糖体、tRNA、酶等"翻译机器"，加入 DNA 模板、氨基酸和能量物质，在试管里直接合成蛋白。因为没有活细胞，毒性蛋白也能做，几小时就有结果，但产量有限、成本较高。

瞬时转染 vs 稳定细胞株

在哺乳动物细胞中表达，有两种完全不同的路线。瞬时转染是把质粒送进细胞，质粒不整合进细胞的染色体，细胞在之后约一周多的时间里表达蛋白，随着细胞分裂和质粒丢失，表达逐渐停止，每次生产都要重新转染。稳定细胞株则是让目标基因整合进宿主染色体，再经过药物筛选和单克隆挑选，得到一株能长期、稳定、高产表达的细胞，之后每次生产都从同一个细胞库开始。

融合标签：给蛋白装"把手"、穿"救生衣"

融合标签是在基因层面接在目标蛋白 N 端或 C 端的一段额外肽段或蛋白。它的作用主要有四种：方便纯化（用能特异结合标签的填料把蛋白捞出来，第 06 节）、帮助可溶（MBP、SUMO 等本身很好溶的蛋白，能带着目标蛋白一起溶解）、方便检测（用识别标签的抗体做 Western blot 等，不需要针对目标蛋白本身的抗体）、改变体内性质（如 Fc 标签延长半衰期）。

标签放在哪一端？标签可能挡住活性位点或干扰折叠，放 N 端还是 C 端要结合结构来判断；分泌蛋白的 N 端有信号肽，标签常放在 C 端或信号肽之后。

标签要不要切掉？小标签（如 His）对很多用途影响不大，可以保留；但标签可能影响蛋白的结构、活性或结晶，在药物中还可能带来免疫原性风险，大的助溶标签通常也要切掉。做法是在标签和目标蛋白之间设计一个蛋白酶识别位点：最常用的 TEV 蛋白酶识别 7 个氨基酸的序列 ENLYFQ(G/S)，在 Q 与 G/S 之间切开，目标蛋白 N 端只多留 1 个氨基酸；此外还有 HRV 3C 蛋白酶、凝血酶、SUMO 蛋白酶等。切完后要把标签和蛋白酶去掉（第 06 节的"反向镍柱"）。

06纯化：从成千上万种蛋白中把目标"捞"出来

细胞裂解液里有几千种蛋白，还有核酸、脂类和内毒素。纯化就是保留目标、去除其他。

纯化之前：破碎细胞与澄清

如果蛋白是分泌表达的，它已经在培养液里，只需离心或过滤去掉细胞，就得到含目标蛋白的培养上清。如果蛋白留在细胞内（大肠杆菌表达最常见），就要先把细胞收集起来、打破，把蛋白放出来：

裂解缓冲液里常加入蛋白酶抑制剂（防止目标蛋白被宿主蛋白酶切碎）和核酸酶（降解释放出来的 DNA，否则裂解液会非常黏稠）。破碎后进行澄清：高速离心，可溶蛋白留在上清，细胞碎片和包涵体沉到沉淀里；上清再经过滤，去掉细小颗粒，以免堵塞层析柱。膜蛋白比较特殊，需要用温和的去垢剂（或纳米盘等）把它从细胞膜里"溶"出来，并在整个纯化过程中保护它的疏水表面。

这样得到的粗提液里有宿主细胞蛋白（HCP）、核酸、脂类、内毒素，还可能有目标蛋白的降解片段和聚集体。不同用途对纯度的要求差别很大：免疫动物用的抗原可能 85%–90% 纯度就够用，晶体学通常要求高纯度且非常均一，药物则要满足严格的法规标准。纯化通常分三个阶段：

层析：让蛋白"赛跑"

层析（色谱）的原理是：柱子里装着填料（多孔的树脂小球），样品溶液流过时，不同蛋白与填料"互动"的强弱不同，于是先后流出、彼此分开。根据分离依据，最常用的有三大类：

再加上疏水相互作用层析和主要用于多肽的反相色谱，常见层析类型对比如下（各类型的细节见后文）：

亲和层析：镍柱与 His 标签

第 05 节讲过，人们常在基因层面给蛋白接上一段亲和标签。最常用的是 His 标签：6 个（或更多）连续的组氨酸，能与填料上螯合的镍离子（Ni²⁺）或钴离子结合，这种方法叫固定化金属离子亲和层析（IMAC），俗称"镍柱"；最常见的填料是用次氮基三乙酸（NTA）把镍离子固定在树脂上，称为 Ni-NTA。流程分四步：先平衡柱子；上样后带 His 标签的目标蛋白被抓住，其余杂蛋白直接流出（流穿）；再用含少量咪唑的缓冲液洗杂，洗掉弱结合的杂蛋白；最后加入高浓度的咪唑（结构与组氨酸侧链相似）洗脱，它与 His 标签竞争镍离子，把目标蛋白"顶"下来。

如果要切掉标签（第 05 节），可在镍柱洗脱后加入带 His 标签的 TEV 蛋白酶进行酶切，然后再过一次镍柱：没有标签的目标蛋白直接流出，切下的 His 标签、未切开的蛋白以及带 His 标签的蛋白酶都留在柱上，这叫反向镍柱。

离子交换：按电荷分

每个蛋白都有一个等电点（pI）。当缓冲液 pH 高于 pI 时，蛋白净带负电；pH 低于 pI 时，净带正电。离子交换填料表面带有电荷：阴离子交换填料（如 Q、DEAE）带正电，抓住带负电的蛋白；阳离子交换填料（如 SP、CM）带负电，抓住带正电的蛋白。结合后逐渐提高盐（NaCl）浓度，盐离子与蛋白竞争填料上的电荷位点：带电弱的蛋白先被洗下来，带电强的后被洗下来。

分子排阻：按大小分

分子排阻层析（SEC）也叫凝胶过滤。填料是带有许多微孔的小球，与蛋白之间没有化学结合。大分子钻不进孔，只能从小球之间的缝隙快速通过，所以大分子先流出；小分子能钻进孔里，走的路程更长，后流出。完全进不了孔的大分子最早流出，流出位置叫空体积（V₀）；能自由钻进所有孔的最小分子最晚流出，位置接近柱体积（Vt）；蛋白都在这两者之间按大小排队。SEC 的分辨率有限（分子量相差不到约 2 倍的蛋白峰容易重叠），上样体积也受限制，所以一般放在最后一步：去除聚集体（聚集体比单体大，先流出）、分析单体比例，以及把蛋白换到最终缓冲液中。

疏水相互作用层析：按表面疏水性分

即使折叠好的蛋白，表面也有一些疏水的小区域。疏水相互作用层析（HIC）先在高盐（如硫酸铵）条件下上样：大量盐离子"抢走"水分子，迫使蛋白表面的疏水区域去和填料上的疏水基团结合；然后逐步降低盐浓度，疏水性弱的蛋白先洗脱，疏水性强的后洗脱。聚集体通常比单体暴露更多疏水表面、结合更牢，所以 HIC 常用于抗体等工艺中去除聚集体。它的条件温和，一般不会让蛋白变性；而反相色谱用有机溶剂洗脱，会让大多数蛋白变性，所以主要用于多肽。

抗体纯化：Protein A 亲和层析

Protein A 是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，能特异地结合 IgG 的 Fc 区。抗体在中性 pH 下被柱子抓住，其余杂质流走，再用低 pH（约 pH 3–4）洗脱，一步就能得到高纯度抗体，因此是抗体纯化的"标配"。在抗体药生产中，Protein A 捕获之后通常紧接着低 pH 孵育以灭活可能存在的病毒，再用离子交换等步骤精纯，最后经过病毒过滤和超滤换液。此外，Protein G（来自链球菌）能结合更多种类和亚型的 IgG；Protein L 结合部分轻链（κ 链），可以纯化不含 Fc 的抗体片段。

模拟器里还能看到一种有趣的情况：选择合适的柱子和 pH，让目标蛋白不结合、直接流穿，而杂质被柱子吸附。这种"流穿模式"也是常用的纯化思路，例如抗体工艺中常用阴离子交换柱以流穿模式去除残留的核酸、内毒素和宿主蛋白。

典型纯化路线：捕获、中间纯化、精纯

把上面的工具按"捕获、中间纯化、精纯"的顺序组合起来，就是一条纯化路线。两个最常见的例子：

每多一步纯化，纯度提高，但总会损失一部分蛋白（收率下降，第 07 节会算），所以步骤不是越多越好，而是够用就好。

换液与浓缩：透析和超滤

层析洗脱下来的蛋白常含有咪唑、高盐或低 pH 缓冲液，体积也可能偏大，交付或下游实验前要换液（换成需要的缓冲液）和浓缩。两种基本工具都用到一张只让小分子通过的半透膜，膜的孔径用截留分子量（MWCO）表示，例如 10 kDa 的膜，大于约 10 kDa 的蛋白基本留下，盐、咪唑、水分子可以通过。通常选 MWCO 明显小于目标蛋白分子量的膜（经验上约为蛋白分子量的一半到三分之一以下）。

• 透析：把样品装进透析袋或透析盒，泡在大体积的新缓冲液里，小分子靠扩散慢慢进出，直到内外平衡；中间更换几次外液。操作温和、简单，但耗时（数小时到过夜），不能浓缩。
• 超滤：用离心力或压力把水和小分子"挤"过膜，蛋白被截留在膜上方，体积越来越小，于是浓缩；一边超滤一边反复补加新缓冲液，原来的小分子被逐步"洗"出去，就完成了换液（称为渗滤）。实验室常用离心超滤管，生产中用切向流过滤（TFF）。

另外，装有 SEC 填料的脱盐柱能在几分钟内把蛋白和小分子分开，也常用于快速换液。浓缩时要注意：浓度过高可能引发聚集和沉淀，部分蛋白会吸附在膜上造成损失。

07质量检测：是不是它？有多纯？有多少？干净吗？

纯化好的蛋白交付前要回答五个问题，每个问题都有对应的检测方法。

SDS-PAGE：按分子量把蛋白排队

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳）是蛋白实验室最常用的检测方法，由莱姆利（Laemmli）在 1970 年发表的方法奠定了今天的标准做法。原理分三步：

1. 变性并统一电荷：样品加入 SDS 并加热，蛋白完全展开；SDS 大量结合在肽链上，使所有蛋白都带上大量负电，且电荷量大致与链长成正比，蛋白自身原有电荷的影响被"淹没"。如果再加入还原剂，二硫键也被打开。
2. 筛分：通电后，带负电的蛋白向正极移动。聚丙烯酰胺凝胶像一张细密的网，小蛋白穿行容易、跑得快，大蛋白跑得慢。于是蛋白基本只按分子量排开。
3. 染色与读胶：用考马斯亮蓝等染料染色后出现一条条蓝色条带。迁移距离与分子量的对数大致呈线性关系，对照已知分子量的 Marker（分子量标准）就能估算样品分子量；条带越粗越深，量越多。

还原与非还原：上样缓冲液里加入 DTT 或 β-巯基乙醇等还原剂，叫还原 SDS-PAGE，二硫键被打开，靠二硫键相连的亚基彼此分开；不加还原剂叫非还原 SDS-PAGE，二硫键保持完整。以 IgG 为例：非还原条件下四条链连在一起，只看到约 150 kDa 一条带；还原条件下分成约 50 kDa 的重链和约 25 kDa 的轻链两条带。两种条件对照着跑，可以判断蛋白有没有正确形成链间二硫键。

染色：最常用的是考马斯亮蓝染色，操作简单，蓝色深浅与蛋白量大致成正比，适合估算纯度；银染灵敏度更高，能看到很微量的杂带，但定量性较差。

怎么读胶：先看 Marker，确定每条带大约多大；再横向比较各泳道。表达实验里常把这几种样品并排上样：诱导前和诱导后的全细胞裂解液（诱导后新出现或明显变粗的条带就是目标蛋白）；破菌离心后的上清（可溶部分）和沉淀（不溶部分，包涵体在这里）；以及纯化后的样品（理想情况下几乎只剩一条带）。目标条带在上清里多还是在沉淀里多，就回答了"可溶还是包涵体"。

胶上的分子量和理论值对不上，怎么回事？

SDS-PAGE 给出的只是表观分子量，与按序列算出的理论值有偏差很常见。常见原因有四类：

• 糖基化：糖链增加质量，且糖型不均一，糖蛋白常表现为比理论值大、较宽或弥散的条带。哺乳动物细胞表达的蛋白尤其常见。可用 PNGase F 等糖苷酶去掉 N-糖链后再跑胶，条带向理论值移动就说明是糖链造成的。
• 降解：蛋白被切断会出现比理论值小的条带，而不是变大。
• 标签和信号肽：别忘了加上标签的分子量，或扣除被切掉的信号肽。
• 特殊组成与非还原条件：电荷特别多、富含脯氨酸或疏水性很强的蛋白（如膜蛋白）结合 SDS 的量不同，迁移可能偏快或偏慢；非还原条件下蛋白更紧凑可能跑得偏快，而靠二硫键相连的亚基仍连在一起，表现为更大的分子量。

所以要确认精确质量，最终要靠质谱。

Western blot、SEC-HPLC 与质谱

Western blot（免疫印迹）先跑 SDS-PAGE，再把蛋白转移到膜上，用特异抗体检测目标蛋白，能在复杂混合物中确认"这条带就是它"。如果蛋白带 His 或 Flag 标签，可以直接用抗标签抗体检测。它依赖抗体，下一模块 M6 会详细讲。

SEC-HPLC 是分析型的分子排阻层析，可以定量单体、聚集体（高分子量物质，先出峰）和片段（低分子量物质，后出峰）各占多少，用峰面积百分比表示，是抗体等蛋白最重要的纯度指标之一。

质谱（MS）把分子变成带电离子，按质量与电荷之比精确称重。在蛋白检测中有两种常见用法：一是完整分子量测定，直接测整个蛋白的精确质量，与理论值对比，确认序列是否正确、末端有没有被切掉、带了哪些修饰；二是肽图，先用胰蛋白酶等把蛋白切成许多肽段，再用液相色谱分离、质谱逐个鉴定，看这些肽段能覆盖多少序列，并定位修饰发生在哪个氨基酸上。

浓度测定：A280、BCA 与 Bradford

比尔–朗伯定律：A = ε × c × l。吸光度 A 等于消光系数 ε 乘以浓度 c 再乘以光程 l（通常 1 cm）。只要知道蛋白的消光系数，测出 A280 就能直接算出浓度。蛋白领域常用"1 mg/mL 溶液在 1 cm 光程下的 A280"作为消光系数，这样计算最直观：浓度（mg/mL）= A280 × 稀释倍数 ÷（该系数 × 光程）。

消光系数从哪来？在 280 nm 处吸光的主要是色氨酸和酪氨酸，以及两个半胱氨酸形成的二硫键。所以只要知道序列，就能用经验公式估算摩尔消光系数：

ε（M⁻¹·cm⁻¹）≈ 5500 × 色氨酸数 + 1490 × 酪氨酸数 + 125 × 二硫键数

再除以分子量（Da），就得到 1 mg/mL 时的 A280。ExPASy ProtParam 等工具会自动完成这些计算。由此也能理解：不含色氨酸和酪氨酸的蛋白或多肽，几乎不吸收 280 nm 光，不能用 A280 测浓度，要改用 BCA 等方法。实际测量时，读数最好落在约 0.1–1.0 之间：太高时多数分光光度计线性变差，应稀释后重测再乘回稀释倍数；太低则误差大。同时看 A260/A280 比值，明显偏高提示有核酸污染，会让 A280 结果偏高。

计算器同时给出摩尔浓度（μM）：把 mg/mL（即 g/L）除以分子量（g/mol）就得到 mol/L。做结合实验、酶动力学时常要用摩尔浓度，因为分子之间是按个数配比反应的。

内毒素：看不见的"污染"

内毒素是革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。它对人和动物的免疫系统是强烈的"危险信号"，极少量就能引起发热和炎症反应，在细胞实验中也会激活免疫细胞、干扰结果。所以凡是用于细胞实验、动物实验，尤其是注射用的蛋白，都必须控制内毒素。

内毒素常用鲎试剂（LAL）法检测，单位是 EU（内毒素单位），蛋白产品常以 EU/mg 表示。用大肠杆菌表达的蛋白天然面临内毒素问题，需要专门的去除步骤（如阴离子交换层析、专用的内毒素去除填料等）；但内毒素也可能来自水、试剂和器具，所以真核系统生产的蛋白同样需要检测。

活性检测：纯 ≠ 有用

一管蛋白可能纯度很高，却因为折叠错误而没有活性。所以对功能要求高的用途，需要做活性检测：酶测催化速率；细胞因子测刺激细胞增殖等生物学功能（细胞实验）；抗体、受体等结合蛋白则测结合能力：

• ELISA（酶联免疫吸附实验）：把一方固定在微孔板上，加入另一方，再用带酶标记的抗体显色，颜色越深结合越多。通量高、成本低，常用来比较"结合强不强"，M6 详讲。
• SPR（表面等离子共振）和 BLI（生物膜干涉）：把一方固定在芯片或探针表面，让另一方流过或浸入，仪器不需要任何标记，就能实时记录分子结合上去、再解离下来的过程，从而算出结合快慢、解离快慢和亲和力。

描述结合强弱最常用的指标是平衡解离常数 K_D。可以这样理解：在达到平衡时，让一半结合位点被占据所需的配体浓度就是 K_D。所以 K_D 越小，说明很低的浓度就能结合上，亲和力越强。K_D 的单位是摩尔浓度，常见的有 μM（微摩尔）、nM（纳摩尔，1 nM = 10⁻⁹ M）、pM（皮摩尔）；治疗性抗体与抗原的 K_D 通常在 nM 到 pM 范围。SPR/BLI 测得的 K_D 等于解离速率常数除以结合速率常数：结合得快、解离得慢，K_D 就小。

纯度与收率的计算

纯度回答"这管东西里有多少是目标蛋白"。SDS-PAGE 可以用灰度扫描软件计算目标条带占该泳道所有条带总量的百分比；SEC-HPLC 则用主峰（单体）面积占总峰面积的百分比。两种纯度含义不同：SDS-PAGE 纯度主要反映杂蛋白多少，SEC 纯度反映聚集体和片段多少，报告中要写明用的是哪种方法。

收率回答"纯化过程中保住了多少目标蛋白"：

收率 = 纯化后得到的目标蛋白量 ÷ 起始时的目标蛋白量 × 100%

蛋白的量等于浓度乘以体积。例如镍柱洗脱后得到 15 mL、浓度 2.0 mg/mL 的蛋白，就是 30 mg。多步纯化的总收率等于各步收率相乘：如果三步的收率分别是 80%、70% 和 85%，总收率约为 0.80 × 0.70 × 0.85 ≈ 48%，还不到一半。这就是为什么纯化步骤要精简：每多一步，纯度可能更高，但蛋白也会损失一部分。

08储存与稳定性：让蛋白"保鲜"

千辛万苦纯化出来的蛋白，如果保存不当，几天内就可能聚集、降解、失活。

蛋白质离开细胞后并不稳定。第 03 节讲过，维持高级结构的大多是较弱的非共价作用，条件稍有变化就可能变性；放置过程中会慢慢发生各种变化：聚集（最常见，溶液变浑或出现沉淀）、降解（残留的蛋白酶把它切碎）、化学变化（例如某些氨基酸被氧化）、吸附（稀溶液中的蛋白粘在管壁上损失掉），以及微生物污染。储存的目标就是把这些变化放慢。

缓冲液里放什么

蛋白溶在什么液体里，对稳定性影响很大。常见成分和作用如下：

温度与形态：放在哪里、放多久

为什么反复冻融伤害大？每冻一次，蛋白都要经历冰晶形成、局部浓度和 pH 剧烈变化、在冰–液界面展开；每融一次又要回到溶液。这些伤害会累积，表现为聚集增多、活性下降。所以分装后冻存、每管只冻融一次是最基本的保存原则。使用前，解冻的蛋白要轻柔混匀、放在冰上，必要时短暂离心，把可能形成的少量聚集体沉下去后取上清使用。

09多肽 vs 重组蛋白：化学合成与生物合成

短的用化学方法"拼"出来，长的让细胞"造"出来。

多肽和蛋白质本质上都是氨基酸链，主要区别在长度。两者没有严格界限，常见说法是以约 50 个氨基酸为粗略分界：短的叫多肽，长的、能折叠成稳定三维结构的叫蛋白质。生产方式也随之不同：多肽通常化学合成，蛋白质通常重组表达。

固相多肽合成（SPPS）

1963 年，梅里菲尔德（Bruce Merrifield）发表了固相多肽合成方法：把第一个氨基酸的羧基端固定在不溶的树脂小球上，然后一个一个地往上接。每一步反应后，只需把树脂冲洗干净就能除去多余的试剂，不必逐步分离产物，因此可以自动化。他因此独享 1984 年诺贝尔化学奖。

1. 固定：第一个氨基酸（多肽的 C 端）通过羧基连接在树脂上；
2. 脱保护：用碱（常用哌啶）去掉 N 端的 Fmoc 保护基，露出氨基；
3. 偶联：加入下一个已活化、N 端带保护基的氨基酸，与露出的氨基形成肽键；侧链上的活泼基团也都带着保护基，避免副反应；
4. 洗涤：冲掉多余试剂，然后回到第 2 步，循环直到最后一个氨基酸；
5. 切割：用三氟乙酸（TFA）把多肽从树脂上切下，同时去掉侧链保护基，得到粗肽；
6. 纯化与鉴定：用反相 HPLC 纯化，用质谱确认分子量。

注意方向：核糖体从 N 端向 C 端合成，化学合成则从 C 端向 N 端进行。

未完全反应的链会产生缺少一个或几个氨基酸的"缺失肽"，它们与正确产物非常相似，很难分离。所以常规固相合成通常适合几十个氨基酸以内的多肽；更长的序列需要分段合成再连接，或者干脆改用重组表达。除了长度，序列本身也影响难度：疏水氨基酸多、容易在树脂上聚集的序列，以及含多个半胱氨酸的序列，合成和纯化都更难，合成好的疏水肽还可能难以溶解。

多肽的纯度：按用途选

多肽的纯度用反相 HPLC 测定：主峰面积占所有峰面积的百分比。纯度要求越高，纯化损失越大、价格越高，所以要按用途选择。常见的思路是：用于免疫动物制备抗体、初步筛选时，较低纯度（如 70%–85%）往往够用；用于 ELISA、细胞实验、酶底物等定量实验时，常要求 > 90% 或 > 95%；用于结构研究、体内实验或作为标准品时，要求 > 95% 甚至更高。另外，切割和 HPLC 纯化用到三氟乙酸（TFA），多肽常以 TFA 盐的形式交付，残留的 TFA 可能影响细胞实验，必要时可换成醋酸盐或盐酸盐。

多肽的修饰：化学合成的强项

化学合成还能用上细胞不会用的"积木"。非天然氨基酸是 20 种标准氨基酸以外的人工设计的氨基酸，可以带来新的化学性质。D 型氨基酸则与天然氨基酸互为"镜像"：除甘氨酸外，氨基酸都有左手型（L 型）和右手型（D 型）两种构型，生物体内的蛋白几乎只用 L 型，而体内的蛋白酶也只认 L 型，所以在多肽中引入 D 型氨基酸可以让它更耐降解。这些都是重组表达很难做到的。

多肽的用途

抗原：用一段多肽免疫动物，制备识别该序列的抗体，不需要先表达整个蛋白。表位研究：把蛋白序列切成一系列相互重叠的短肽，逐个检测，找出抗体或 T 细胞识别的精确区域。多肽药物：例如 GLP-1 类药物司美格鲁肽。天然 GLP-1 在体内几分钟就会被 DPP-4 酶降解；司美格鲁肽替换了个别氨基酸以抵抗降解，并连接了一条脂肪酸侧链，使其能与血液中的白蛋白结合，半衰期延长到约一周，因此可以每周注射一次，用于 2 型糖尿病和肥胖症的治疗。

两者的界限正在模糊：一些多肽药物也可以通过重组表达骨架再化学修饰来生产，具体选择取决于长度、修饰和经济性。

怎么选：多肽还是重组蛋白？

• 看长度：几十个氨基酸以内，优先考虑化学合成；上百个氨基酸、需要折叠成稳定结构的，用重组表达。
• 看是否需要三维结构：只需要一段线性序列（如制备识别线性表位的抗体、做酶底物、表位作图），多肽就够了；需要天然构象、需要酶活或受体结合功能的，通常要重组蛋白。
• 看修饰：需要在指定位置精确引入磷酸化、荧光基团、生物素、非天然或 D 型氨基酸、环化等，化学合成更有优势；需要复杂糖基化的，只能靠真核表达。
• 看用量和周期：短肽合成快、批间一致性好；大量的长链蛋白用重组表达更经济。

10联系工作：客户常问的问题背后是什么知识

把本模块的知识点串起来，用在真实的沟通场景里。

11术语卡片：点击翻面

先看正面自己解释一遍，再翻过来核对。

12模块测验

14 道题，答完自动计分，成绩会记录在课程首页。每题解析末尾都有"回看"链接，可跳回对应章节。

延伸资源

• Khan Academy 生物学：Macromolecules 单元中的蛋白质结构（Protein structure）部分，有配套练习。
• PDB-101（pdb101.rcsb.org）：蛋白质数据库的教育版，"Molecule of the Month"栏目每期用图文讲一个蛋白的结构和功能。
• AlphaFold 蛋白结构数据库（alphafold.ebi.ac.uk）：输入蛋白名称即可查看预测结构，颜色表示置信度。
• ExPASy ProtParam：粘贴一段蛋白序列，自动计算分子量、等电点和消光系数，可以拿来验证本模块"每个氨基酸约 110 Da"的估算。
• 搜索"SDS-PAGE 原理动画""蛋白纯化 层析 原理动画"：直观看到蛋白在凝胶和层析柱中如何分离。
• 工作练习：在 UniProt 中查一个你熟悉的蛋白（如人胰岛素或 EPO），找出它的长度、信号肽、二硫键和糖基化位点，再想想它适合用哪个表达系统。