M7 生物药与细胞基因治疗

本模块你将学会

这是课程里信息量最大的一个模块，建议第 10 周学 01–05，第 11 周学 06–13。

• 说出药物的主要模态，并从分子量、生产方式、给药途径、靶点位置、半衰期、免疫原性等方面比较小分子与生物药
• 按顺序讲清一个抗体药从细胞株开发、细胞库、上游培养、下游纯化到质量放行的流程，说出几个关键质量属性
• 解释抗体药的三类作用机制，以及 Fc 工程、双特异性抗体、ADC、Fc 融合蛋白、纳米抗体和生物类似药的设计思路
• 画出 CAR 的结构，描述 CAR-T 的制备流程、主要不良反应、自体与通用型的区别，并认识 TCR-T、CAR-NK、TIL 和干细胞疗法
• 区分体内与体外基因治疗，比较 AAV、慢病毒、腺病毒和非病毒载体，说明病毒载体怎么生产、滴度怎么表示、空壳为什么重要
• 说清 ASO、siRNA、mRNA、适配体和 CRISPR 疗法分别作用在中心法则的哪个环节，以及化学修饰为什么重要
• 从产业视角认识各类疫苗的生产平台
• 在产业链上定位各类需求，区分 CRO、CDMO、CMO，听懂客户关于质粒、病毒载体、ADC、CAR-T 放行的常见说法

01药物的"模态"：同一个靶点，多种打法

modality 在业内指药物分子的类型。选择哪种模态，决定了怎么研发、怎么生产、需要什么原料。

药物的本质是"能改变某个生物过程的物质"。几十年前，药物几乎就等于化学合成的小分子；今天，药企手里的"武器类型"多了很多，业内把这些类型称为药物模态（modality）。同一种疾病、甚至同一个靶点，可以用不同的模态去攻：以 HER2 阳性乳腺癌为例，既有小分子激酶抑制剂（如拉帕替尼），也有单克隆抗体（曲妥珠单抗），还有抗体偶联药物（T-DM1、T-DXd）。

把这些模态按"药物本身有多大、多复杂"排成一条谱系，就能看出一条规律：越往右，分子越大、结构越复杂，越依赖活细胞或病毒来生产，也越可能"一次治疗、长期起效"；越往左，越容易用化学方法精确合成、越容易口服，但通常需要反复服药。抗体偶联药物（ADC）是把抗体和小分子毒素连在一起的"混血儿"，所以夹在中间；核酸药物里的 siRNA 和 ASO 虽然作用于 RNA，却是用化学合成生产的。

1 kDa = 1000 Da。道尔顿（Da）是分子质量单位，约等于一个氢原子的质量。

小分子与生物药：不只是"大小不同"

"生物药"（biologics）泛指由活细胞等生物体系生产的药物，最典型的是重组蛋白和单克隆抗体。下表把它和传统小分子药放在一起逐项比较。表中的 CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞）是目前生产抗体药最常用的哺乳动物"细胞工厂"，M1 已经介绍过；半衰期指药物在血液中的浓度下降一半所需的时间，半衰期越长，给药间隔就可以越长；免疫原性指药物本身被免疫系统当作"外来物"、诱发抗体的倾向，这种针对药物的抗体叫抗药抗体（ADA）。

仿制药与生物类似药：为什么"仿版"叫法不同？

药物专利到期后，其他企业可以做"仿版"。小分子药的仿版叫仿制药（generic）：它与原研药含有完全相同的活性成分，只要证明药物在人体内的吸收和暴露量相当（称为生物等效）即可上市。

生物药的仿版叫生物类似药（biosimilar）。生物药是活细胞做出来的，仿制者拿不到原研企业的细胞株和工艺细节，只能从头建立自己的细胞株和工艺，做出的产品在糖型、电荷变体等方面不可能百分之百相同。所以监管机构要求生物类似药通过结构与功能分析、非临床研究和临床比较，证明与原研药高度相似、且没有临床意义上的差异。这比开发小分子仿制药复杂得多、昂贵得多。美国首个生物类似药是 2015 年获批的非格司亭生物类似药（Zarxio）；中国首个生物类似药是 2019 年获批的利妥昔单抗生物类似药（汉利康）。注意：生物类似药并不是"疗效更差的药"，而是"证明了与原研药没有临床意义差异的药"。

02生物药是怎么"养"出来的（上）：细胞株、细胞库与上游

小分子药靠"合成"，生物药靠"养"。下面以单克隆抗体为例，先用一张动画看全流程，再分两节细讲。

一个抗体药的生产通常分成几段：上游（USP）负责让细胞长起来、把抗体分泌出来；下游（DSP）负责把抗体从成分复杂的培养液里纯化出来，并确保没有病毒等安全隐患，得到原液（Drug Substance，DS）；接着加入辅料、灌装，得到制剂（Drug Product，DP）；质量控制贯穿始终，每一批都要检测合格才能放行。

第一步：细胞株开发——找到一个"冠军细胞"

生物药生产的起点是一株能稳定、高效分泌目标蛋白的细胞，称为生产细胞株（cell line）。细胞株开发（CLD）通常要花几个月，包括五个环节：

1. 构建表达载体：把编码抗体重链和轻链的基因（常经过密码子优化，M3 讲过）连同启动子、筛选标记一起装进质粒。
2. 转染：用电穿孔或化学试剂把质粒送进宿主细胞（抗体药最常用 CHO 细胞）。只有极少数细胞会把外源基因整合进自己的基因组，而整合是长期稳定表达的前提。
3. 筛选：给细胞施加"生存压力"，只让整合了载体的细胞活下来。常见的 GS 体系利用谷氨酰胺合成酶（GS）基因作标记：培养基里不给谷氨酰胺，只有带上载体、能自己合成谷氨酰胺的细胞才能存活；DHFR 体系原理类似，用二氢叶酸还原酶基因配合相应药物筛选。
4. 单克隆化：筛选后活下来的是一群"各不相同"的细胞，基因插入的位置和拷贝数都不一样。必须从单个细胞出发扩增出一个克隆（常用有限稀释、单细胞分选或打印，并用显微成像记录"孔里确实只有一个细胞"），这样整个生产细胞群才遗传一致。监管机构会要求提供单克隆性证明。
5. 克隆评估与稳定性研究：在几百到上千个克隆里比较表达量、生长速度、产品质量（如糖型、聚集），挑出几个候选，再连续传代培养几十代，确认表达量和产品质量不会随时间明显漂移，最终选定"冠军克隆"。

第二步：细胞库——每一批都从同一管细胞出发

选定克隆后，要把它扩增并分装成大量冻存管，保存在液氮（常为液氮气相）中，建立两级细胞库：

两级设计的意义在于：一支 MCB 可以做出一整套 WCB，一套 WCB 又能支撑很多批生产，这样几十年里每一批产品都源自同一株、同一代次范围内的细胞，批与批之间才有一致性，同时也降低了把唯一的细胞库用完或污染的风险。

第三步：上游——从摇瓶到生物反应器

上游工艺（USP）的任务是让细胞长得多、长得好，并分泌足够多、质量合格的抗体。从 WCB 取出一支冻存管复苏后，先在摇瓶里培养，再逐级放大到更大的种子反应器（这一串放大步骤叫种子扩增），最后接种到生产用的生物反应器。生物反应器本质上是一个能精确控制环境的"大罐子"：传统的是可反复使用的不锈钢罐，近年大量使用一次性反应器（用一次性的无菌塑料袋代替罐体），省去清洗和清洁验证，降低交叉污染风险，特别适合多产品、中小规模的 CDMO 工厂。

培养过程中要实时监测和控制一组关键工艺参数：

• 温度：CHO 细胞通常在约 37 ℃ 下生长，后期有时降温以减缓生长、延长高产期；
• pH 与二氧化碳：维持在接近中性的范围，靠通入 CO₂ 和加碱调节；
• 溶解氧（DO）与搅拌：细胞要呼吸，但搅拌太猛、气泡太多会产生剪切力伤害细胞；
• 营养与代谢物：葡萄糖、氨基酸要及时补充，乳酸、氨等代谢废物积累过多会抑制细胞；
• 活细胞密度与活率：反映细胞"状态"，决定什么时候补料、什么时候收获。

这些参数不仅影响产量，也会影响产品本身的质量，例如糖链的样子（下一节的"质量属性"）。

不同产品、不同工艺差异很大，以上为行业常见量级，仅供建立概念。业内说的"滴度"（titer）就是每升培养液里含多少克目标蛋白。按约 5 g/L 估算，一罐 2000 L 的培养液理论上含约 10 kg 抗体，经过下游损失后得到的会少一些。

03生物药是怎么"养"出来的（下）：下游纯化、质量属性与 GMP

收获液里抗体只占一小部分。下游要把它"淘"出来，还要证明每一批都干净、安全、一致。

培养结束时，抗体分泌在培养液里，同时混着细胞和碎片、宿主细胞蛋白（HCP）、宿主 DNA、培养基成分，以及理论上可能存在的病毒。下游工艺（DSP）用一连串原理不同的步骤，把抗体逐步纯化到注射用的标准。典型的抗体下游流程如下：

质量属性：怎么判断"这一批抗体"合格？

同一批抗体里，分子并不完全一样。描述这些差异的指标叫质量属性；其中会影响安全性、有效性的，叫关键质量属性（CQA）。抗体最常被讨论的三个 CQA 是：

此外，片段、氧化、宿主细胞蛋白和 DNA 残留、Protein A 残留等也都要控制。M5 讲过的糖基化在这里变成了实实在在的质量指标：培养温度、pH、补料策略、溶氧，甚至培养基某种成分的批次，都可能改变糖型。这就是"工艺即产品"的根源。

批次、放行与 GMP

生物药按批（batch / lot）生产和管理：一次从 WCB 出发、经过上下游得到的一批产品有唯一的批号，从原料、设备、操作人员到每个参数都记录在批记录中，出了问题能追溯到源头。每一批都要检测合格才能放行，典型检测包括：鉴别（确认是这个抗体）、纯度与杂质（聚集体、片段、HCP、残留 DNA）、含量、生物学活性（效价）、安全性（无菌、细菌内毒素、支原体、外源病毒等）。质量受权人审核整批生产与检验记录后，才能签字放行。下面四个概念会反复出现（GMP 与质量体系在 M8 详细展开）：

正因为"工艺即产品"，任何工艺变更（换培养基、改温度、放大规模、换工厂）都要先评估影响，再做可比性研究：用一整套分析方法比较变更前后的产品，必要时补充非临床或临床数据，证明产品没有发生有意义的变化。这也是药企一旦确定工艺和合作方，就不愿轻易更换的原因之一。

CDMO：药企为什么要"外包"生产？

CDMO（Contract Development and Manufacturing Organization，合同研发生产组织）为药企提供从工艺开发到 GMP 生产的服务。CDMO 的特点是"开发 + 生产"一条龙：从细胞株开发、工艺开发、分析方法开发，到临床样品和商业化生产。它和 CRO、CMO 的区别见第 12 节。

• 建厂太贵、太慢：一座 GMP 生物药工厂需要巨额投资和数年建设与验证期，很多初创生物技术公司（业内常称 Biotech）根本没有自己的工厂。
• 专业经验：CDMO 做过大量项目，有成熟的平台工艺和申报经验，能缩短进入临床的时间。
• 产能弹性与风险分担：药物研发失败率高，自建产能可能闲置；外包可以按需使用。
• 新模态门槛更高：病毒载体、细胞治疗、mRNA 等新模态的工艺和设施要求特殊，外包需求尤其旺盛。

04抗体药物：从"导弹"到"组合武器"

M6 讲了抗体的结构，这里讲它怎么被当作药，以及工程师如何改造它。

1986 年，首个治疗性单克隆抗体（莫罗单抗-CD3，OKT3）获 FDA 批准；如今单抗已是全球销售额最大的一类生物药。抗体能成为好药，靠的是三个特点：特异性高（只结合特定靶点）、半衰期长（IgG 在体内约 3 周，可以几周打一针）、可以被工程化改造（换掉 Fc、变成双抗、挂上毒素）。

M6 讲过，抗体分为两部分：Fab 端（两条"手臂"，负责识别抗原）和 Fc 端（"尾巴"，负责和免疫细胞、补体以及延长寿命的受体打交道）。抗体药的作用机制可以归成三类，前两类主要靠 Fab，第三类需要 Fc：

抗体药的共同局限是分子太大、基本进不了细胞，只能对付细胞表面或细胞外的靶点，也很难穿过血脑屏障。下面的标签页给出每种机制的更多细节和故事。

Fc 工程：给抗体的"尾巴"调参数

Fc 决定了抗体在体内活多久、会不会招来免疫细胞。工程师通过改变 Fc 的少数几个氨基酸或糖链，可以按需调整这两件事：

双特异性抗体：一个分子，两只手

天然 IgG 的两条臂识别同一个抗原。双特异性抗体（双抗）则让两条臂分别识别两个不同的靶点，从而做到单抗做不到的事。按结构，双抗大致分为两类：

按用途，双抗主要有三类：

• T 细胞衔接器：一只手抓肿瘤细胞，另一只手抓 T 细胞上的 CD3，把 T 细胞"拉"到肿瘤旁边直接杀伤，不需要改造 T 细胞。代表是贝林妥欧单抗（也常译作博纳吐单抗），CD19 × CD3，2014 年获 FDA 批准，用于 B 细胞前体急性淋巴细胞白血病。它没有 Fc，分子量约 54 kDa，半衰期只有约 2 小时，需要用输液泵连续静脉输注。后来的 T 细胞衔接器多改为带 Fc 的形式，例如靶向 BCMA × CD3、用于多发性骨髓瘤的特立妥单抗（2022 年获 FDA 批准），可以间隔给药。
• 同时阻断两个靶点：肿瘤或眼病常有两条通路"互为备份"，一个分子同时堵住两条，例如同时阻断 EGFR 和 MET 的埃万妥单抗（amivantamab，肺癌），同时阻断 VEGF-A 和 Ang-2 的法瑞西单抗（faricimab，眼底病）。
• 模拟天然功能：艾美赛珠单抗（emicizumab）同时结合凝血因子 IXa 和 X，模拟缺失的凝血因子 VIII 的桥接作用，2017 年获批用于 A 型血友病，可以皮下注射、间隔较长时间给药。

Fc 融合蛋白：借抗体的"尾巴"

把一个有功能的蛋白（如受体的胞外段）接在 IgG 的 Fc 上，就得到 Fc 融合蛋白。接上 Fc 有三大好处：借助 FcRn 回收机制延长半衰期；Fc 自然形成二聚体，使结合能力增强；生产时可以直接用 Protein A 纯化，沿用抗体的平台工艺。

纳米抗体药物：最小的"抗体手"

M6 讲过，骆驼、羊驼等驼类动物有一种只有重链的抗体，它的单个可变区就能识别抗原，称为 VHH，也叫单域抗体或纳米抗体（nanobody）。它的分子量只有约 15 kDa（约为 IgG 的十分之一），结构稳定，能钻进普通抗体够不着的"凹槽"，还可以用大肠杆菌或酵母表达，并像积木一样把两个、三个串在一起。缺点是太小，单独存在时很快被肾脏清除，常需要串联一个结合白蛋白的模块或接上 Fc 来延长半衰期。

• 卡普赛珠单抗（caplacizumab）：首个获批的纳米抗体药物（2018 年欧盟、2019 年美国），靶向血管性血友病因子，用于获得性血栓性血小板减少性紫癜。
• 恩沃利单抗：2021 年在中国获批的抗 PD-L1 单域抗体-Fc 融合蛋白，可以皮下注射。
• 纳米抗体也常被用作其他药物的"识别模块"：传奇生物的 Carvykti 就用两个靶向 BCMA 的 VHH 作为 CAR 的识别域（第 06 节）。

生物类似药：抗体专利到期之后

第 01 节讲过，生物药的仿版叫生物类似药。很多重磅单抗（如曲妥珠单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗）专利到期后，都出现了多个生物类似药，显著降低了药价、提高了可及性。开发生物类似药的核心工作是"逐项对比"：先买来多批原研药，把它的结构、糖型、电荷变体、活性等摸清楚，作为"靶子"；再开发自己的细胞株和工艺，让产品的各项质量属性落在原研药的波动范围里；最后用药代动力学和临床研究证明没有临床意义的差异。

05ADC：给抗体装上"弹头"

抗体负责"找到"肿瘤，小分子毒素负责"杀死"肿瘤，连接子负责"在对的地方松手"。

抗体偶联药物（ADC）把强效细胞毒药物通过连接子挂在抗体上。毒素单独使用太毒，无法当药；抗体单独使用杀伤力有限。两者结合，就成了"生物导弹"：抗体是制导系统，连接子是挂架和引信，毒素是弹头。ADC 由三个要素组成，外加一个关键指标：

如果释放出来的毒素能穿过细胞膜，它还会扩散到旁边的细胞，连抗原表达低的肿瘤细胞一起杀死，这叫旁观者效应。它对"有的细胞表达抗原、有的不表达"的肿瘤很有帮助，但也可能增加对正常组织的毒性。可裂解连接子配合可穿膜毒素（如 T-DXd）旁观者效应明显；T-DM1 释放的毒素带电荷、不易穿膜，旁观者效应较弱。点击下图，可以逐个查看各部件。

ADC 的作用流程

一个 ADC 分子从输进血管到杀死肿瘤细胞，要依次完成五件事：

1. 循环：在血液中循环，连接子必须稳定，毒素不能提前脱落；
2. 结合：Fab 臂找到并结合肿瘤细胞表面的抗原；
3. 内吞：抗原–ADC 复合物被细胞膜包裹吞进细胞，形成内体（M1 讲过的胞吞作用）；
4. 释放：内体与溶酶体融合，溶酶体里酸性强、蛋白酶多，可裂解连接子在这里被切开，不可裂解连接子则随抗体一起被降解，毒素被释放出来；
5. 杀伤：毒素破坏微管或 DNA，细胞走向凋亡；部分 ADC 的毒素还会扩散到邻近细胞，产生旁观者效应。

同一个靶点、同一个抗体序列，换了连接子、毒素和 DAR，就成了临床表现不同的两个药。T-DXd 说明书中有间质性肺病的黑框警告，ADC 的毒性管理始终是关键问题。

ADC 的生产：生物药与小分子的"合体"

从生产角度看，ADC 同时涉及三条工艺线：抗体（按第 02–03 节的生物药工艺生产，作为"中间体"）、连接子-毒素（多步化学合成的高活性小分子）和偶联工艺（让二者在可控条件下连接，再纯化去除游离毒素）。毒素活性极高，微量吸入或接触就可能伤害操作人员，所以偶联和灌装需要专门的高活性物质防护设施，防止职业暴露。抗体中间体的质量会直接带进 ADC：聚集体多、杂质多，或者缓冲液里含有会干扰偶联反应的成分，都会影响偶联效率和 DAR。

06细胞治疗：会自我扩增的"活药物"

CAR-T 把抗体的"眼睛"装到 T 细胞上，让患者自己的免疫细胞变成精确制导的杀手。

M6 讲过：T 细胞靠 T 细胞受体（TCR）识别抗原，但 TCR 只能识别被 MHC 分子"展示"的短肽片段，而很多肿瘤会降低 MHC 的表达来躲避识别。嵌合抗原受体（CAR）是人工设计的受体：胞外部分来自抗体，能直接识别肿瘤细胞表面的完整抗原、不依赖 MHC；胞内部分来自 T 细胞的信号分子，一旦识别到抗原就激活 T 细胞。把 CAR 基因装进患者的 T 细胞，就得到了 CAR-T。

CAR-T 回输后，遇到表达靶抗原的细胞就会被激活、大量增殖，释放穿孔素和颗粒酶杀死靶细胞，并分泌细胞因子。和抗体药不同，它会在体内自我扩增，部分细胞还能长期存续，所以常被称为"活的药物"，很多患者只需治疗一次。

CAR 的结构：从外到内五个部件

CAR 是一条跨越 T 细胞膜的蛋白链，从细胞外到细胞内依次是：

CAR 的"代际"按胞内信号域划分：第一代只有 CD3ζ（只有信号 1），体内扩增和存续都很差；第二代加入一个共刺激域（CD28 或 4-1BB），目前已获批的 CAR-T 都属于第二代，例如 Kymriah 和 Carvykti 用 4-1BB，Yescarta 用 CD28；第三代同时加入两个共刺激域；第四代及以后让 CAR-T 额外分泌细胞因子，或加入"开关""逻辑门"等设计，以增强功能或提升安全性，多处于研究阶段。

CAR-T 是怎么做出来的

已上市的 CAR-T 大多是自体产品：用患者自己的细胞，一位患者一批。细胞要在医院和 GMP 工厂之间往返一趟，整个周期通常需要数周：

1. 白细胞单采：在医院用单采设备从患者外周血中分离出白细胞，运往工厂。从这一刻起，"身份链"（chain of identity）和"监管链"（chain of custody）必须全程可追溯，绝不能把 A 患者的细胞回输给 B 患者。
2. T 细胞分离与激活：富集 T 细胞，再用包被抗 CD3 和抗 CD28 抗体的磁珠等试剂模拟"信号 1 + 信号 2"把 T 细胞激活，让它开始分裂，更容易被病毒载体转导。
3. 病毒转导：用慢病毒或 γ-逆转录病毒载体把 CAR 基因整合进 T 细胞基因组，这样 T 细胞分裂后每个子细胞都带有 CAR。这些载体已去掉自我复制所需的基因，不能在体内繁殖；病毒载体本身是关键原料，必须在 GMP 条件下生产（第 08 节）。
4. 体外扩增：在含细胞因子（如 IL-2）的培养基中培养数天到两周左右，扩增到目标剂量。患者经多线化疗后 T 细胞状态差时，可能扩增不足，导致制备失败。
5. 质检放行：检测细胞数量与活率、CAR 阳性率、效力、无菌、支原体、内毒素、载体拷贝数（VCN，平均每个细胞整合了几份载体），以及确认没有可复制型病毒（RCL/RCR）。合格后在液氮中冻存，冷链运回医院。
6. 清淋预处理与回输：回输前几天，患者用氟达拉滨联合环磷酰胺等化疗清除部分淋巴细胞，为 CAR-T 腾出"生存空间"；然后解冻、单次静脉回输，CAR-T 在体内扩增并杀伤肿瘤。

适应症与获批里程碑

目前获批的 CAR-T 都用于血液肿瘤，靶点主要有两个：CD19（表达在 B 细胞上，用于 B 细胞急性淋巴细胞白血病和多种 B 细胞淋巴瘤）和 BCMA（主要表达在浆细胞上，用于浆细胞的恶性肿瘤——多发性骨髓瘤）。这些抗原也存在于正常细胞上，所以 CD19 CAR-T 会把正常 B 细胞一起清除，导致"B 细胞缺乏"，患者可能需要补充免疫球蛋白；好在人没有 B 细胞也能靠补充抗体维持，这正是 CD19 成为理想靶点的原因。

自体 vs 异体（通用型）CAR-T

CAR-T 之外的细胞疗法

CAR-T 只是细胞治疗的一种。按"用什么细胞、怎么改造"，常见的还有以下几类：

07基因治疗：把"正确的基因"送进细胞

难点不在"写出正确的基因"，而在于"送到对的细胞、表达足够久、又足够安全"。

很多遗传病是因为某一个基因发生突变、做不出有功能的蛋白（例如 SMA 患者的 SMN1 基因缺失或突变）。基因治疗的思路是：与其每隔一段时间补充蛋白，不如把一份正常的基因送进细胞，让细胞自己长期生产。广义的基因治疗还包括沉默致病基因、编辑基因、改造细胞（如 CAR-T 也被监管机构归入细胞和基因治疗产品）。无论哪一种，核心挑战都是递送：DNA 是带大量负电的大分子，自己进不了细胞，更进不了细胞核，需要"运载工具"——载体（vector）。

四类常见载体

慢病毒源自 HIV-1，经改造后去除了致病和自我复制能力；γ-逆转录病毒与之类似也会整合，但只能转导正在分裂的细胞。部分新冠疫苗采用了腺病毒载体。颗粒尺寸为约数，仅供比较。

两点补充：

• 血清型与组织嗜性：AAV 的蛋白外壳（衣壳）决定它能进入哪些细胞，即组织嗜性。不同的天然或工程化衣壳称为不同的血清型。例如 Luxturna 使用 AAV2，通过视网膜下注射给药；Zolgensma 使用 AAV9，静脉输注后能到达运动神经元。研发人员还会通过定向进化等方法设计新衣壳，以提高靶向性、躲避预存抗体。注意：血清型改变的是"去哪儿"，不改变装载量，所有 AAV 的容量都约为 4.7 kb。
• 预存抗体：AAV 在自然界中广泛存在，很多人小时候感染过，体内已有针对某些血清型的中和抗体。这些抗体会在载体到达目标组织前把它"中和"掉，所以 AAV 基因治疗常要先检测患者的抗体，抗体高的患者可能无法入组；也因为第一次给药后会产生大量抗体，AAV 通常难以重复给药。

载体里装的是什么：表达盒

送进细胞的不只是治疗基因本身，而是一个完整的表达盒，从前到后通常包括：启动子（决定基因在哪些细胞、以多强的水平表达，M3 讲过；CMV、CAG 是强而广谱的启动子，组织特异性启动子只在特定组织里开启）、目的基因的编码序列、polyA 信号（让 mRNA 末端加上 poly(A) 尾，保证稳定和翻译）。AAV 的表达盒两端还要有约 145 个碱基的 ITR（反向末端重复序列），它是包装信号，只有两个 ITR 之间的序列才会被装进病毒。有时还会加入 WPRE（一段来自土拨鼠肝炎病毒的调控元件，约 0.6 kb，能提高表达量），但它会占用宝贵的容量。慢病毒的情况略有不同：它的基因组本身是一条 RNA，表达盒内部如果加 polyA 信号，会让病毒 RNA 提前"收尾"、包装不完整，所以慢病毒表达盒内部一般不加 polyA，由两端的 LTR 负责。

AAV 还有一种变体叫自互补 AAV（scAAV）：基因组设计成能自己折叠成双链，省去细胞合成第二条链的步骤，表达更快更强，但容量只有约一半（约 2.4 kb）。Zolgensma 就采用了自互补 AAV9。下面的工具可以把这些元件加起来，看看能不能装进各种载体。

非病毒递送：不用病毒也能送进去

病毒载体效率高，但生产复杂、可能引起免疫反应、容量有限。非病毒递送用物理或化学方法把核酸送进细胞，常见的有：

• 脂质纳米颗粒（LNP）：用几种脂质把带负电的核酸包成纳米颗粒，保护它不被降解，并帮助它被细胞吞入后从内体"逃逸"到细胞质。mRNA 疫苗、部分 siRNA 药物和体内基因编辑研究都用它；静脉注射后 LNP 主要富集在肝脏。
• 电穿孔：给细胞施加短暂的电脉冲，在细胞膜上打开临时小孔，让核酸或蛋白进入。主要用于体外改造细胞，例如把 CRISPR 编辑工具送进造血干细胞或 T 细胞。
• 转座子系统：借助能在基因组中"跳跃"的 DNA 元件，把目的基因整合进基因组，可作为体外改造 T 细胞时替代病毒载体的方案，多处于临床研究阶段。
• 偶联递送：把核酸直接连在能被特定细胞识别的分子上，例如第 09 节将讲到的 GalNAc-siRNA 能高效进入肝细胞。

基因编辑疗法：不是"补一个基因"，而是"改写原来的基因"

传统基因治疗是"加一份正常基因"；基因编辑则直接修改细胞自己的 DNA。M4 讲过的 CRISPR-Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和一段向导 RNA 组成：向导 RNA 把 Cas9 带到基因组中互补的位置并切开 DNA，细胞修复时就可以实现基因敲除或修改。

首个获批的 CRISPR 疗法是 Casgevy（2023 年 11 月在英国、12 月在美国获批），用于 12 岁及以上的镰状细胞病患者（后来也获批用于输血依赖型 β-地中海贫血）。它是典型的体外编辑：采集患者的造血干细胞，在体外用 CRISPR-Cas9（通过电穿孔导入）破坏 BCL11A 基因的一个红系特异性增强子，重新开启胎儿血红蛋白的表达，以弥补成人血红蛋白的缺陷；患者先接受清髓预处理，再回输编辑后的细胞。前沿方向还包括不切断双链就能改写单个碱基的碱基编辑、先导编辑，以及用 LNP 把编辑工具直接递送到肝脏的体内编辑。基因编辑的特殊风险是脱靶编辑（在不该切的位置切了一刀）和长期安全性未知。

获批案例与风险

把基因治疗的主要安全风险归纳一下：

08病毒载体是怎么生产的：质粒、滴度与空壳

病毒载体既是基因治疗的"药"，又是 CAR-T 的关键原料。它的起点几乎都是质粒。

治疗用的病毒载体必须"只能送货、不能繁殖"。为此，工程师把病毒基因组拆开：要送进患者细胞的那段序列放在转移质粒上，生产病毒所需的结构蛋白和酶的基因放在另外的包装质粒（和辅助质粒）上。几种质粒同时转染进生产细胞（最常用人胚肾来源的 HEK293 细胞，M1 介绍过），细胞就会临时变成"病毒工厂"。由于只有转移质粒上带包装信号的那一段会被装进病毒颗粒，做出来的载体里没有病毒自我复制所需的基因，进入患者细胞后不能再繁殖。拆得越开，几种质粒之间重组出"可复制型病毒"的概率就越低，安全性越好。这种方法叫多质粒瞬时转染。

除了三质粒转染 HEK293，AAV 也可以用昆虫细胞（如 Sf9）配合杆状病毒的平台生产。无论哪种方法，质粒都是起始物料：一批大规模 AAV 生产需要大量高质量质粒，临床阶段还要求质粒本身按 GMP 要求生产。AAV 的生产大致分六步：

1. 准备转移质粒、Rep/Cap 质粒和 Helper 质粒；
2. 用转染试剂（如 PEI）把三种质粒同时送进 HEK293 细胞，质粒的比例、质量和转染条件直接影响产量和空壳率；
3. 细胞核内，衣壳蛋白先组装成空衣壳，再由 Rep 蛋白把 ITR 之间的单链 DNA 装进去，但包装并不完美，会同时产生实壳（装了完整基因组）、空壳（什么都没装）和装了残缺 DNA 的衣壳；
4. 培养数天后收获、裂解细胞，用核酸酶降解游离 DNA，澄清过滤；
5. 用亲和层析捕获 AAV，再用离子交换层析或密度梯度超速离心，利用空壳与实壳在电荷或密度上的细微差别把它们分开，这是 AAV 下游的难点；
6. 检测滴度、空壳比例、纯度、效力和安全性后放行。

慢病毒的流程类似：四种质粒共转染 HEK293（常用其衍生株 HEK293T）细胞后，收集含病毒的培养上清，经澄清、层析、超滤等步骤纯化浓缩。慢病毒有脂质包膜，对剪切力、温度和反复冻融都比较敏感，收率常常是工艺难点。

滴度：病毒载体的"浓度"怎么说

抗体的浓度用"毫克每毫升"就能说清，病毒载体却要分好几种"数法"。业内统称为滴度（titer），常见单位如下：

同一批载体，"物理上有多少颗粒"和"真正能用的有多少"可能相差很大。所以比较两批载体或两家供应商的产品时，必须问清用的是哪种滴度、用什么方法测的，否则数字没有可比性。

09核酸药物：在信息流的不同环节下手

回顾 M3 的中心法则：DNA → RNA → 蛋白质。不同的药物模态，作用在不同的环节。

这张图把 M3 的知识和药物直接对上了号：M3 讲过，基因表达在 RNA 层面也会被调控——前体 mRNA 要经过剪接才能成熟，细胞里的 microRNA 会结合 mRNA、降低它的翻译或促使它降解，这类"小 RNA 让基因沉默"的现象叫 RNA 干扰。核酸药物就是借用了这些天然机制：ASO 改变剪接或降解 RNA，siRNA 借用 RNA 干扰的机器切断 mRNA，mRNA 药物则相当于"额外递上一份翻译模板"。它们都按碱基互补配对去找目标，所以只要知道目标基因的序列，就能设计药物，这是核酸药物研发速度快的根本原因。

四类核酸药物一览

GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）是一种糖分子，肝细胞表面有大量能识别它的受体。把三个 GalNAc 挂在 siRNA 上，皮下注射后 siRNA 就会被肝细胞"认领"吞入。所以凡是"肝脏分泌的某种蛋白太多"的疾病（如高胆固醇、某些遗传性淀粉样变性），都是 GalNAc-siRNA 的理想场景。siRNA 在 RISC 里能反复切割很多个 mRNA 分子，加上肝细胞分裂很慢，作用可以维持几个月。mRNA 则完全不同：它的优势是"快"——只要拿到病原体的基因序列，几周内就能设计并生产出候选疫苗，非常适合应对新发传染病。

化学修饰：核酸药物能成药的关键

天然的 RNA 和 DNA 片段直接注射进人体，会遇到三个问题：血液和组织里到处是核酸酶，几分钟内就会被降解；外来核酸会被先天免疫系统当作"病毒入侵"的信号，引起炎症反应；带大量负电的分子很难进入细胞。化学修饰就是在不破坏碱基配对的前提下，改造核酸的"骨架"和糖环：

• 骨架修饰：把磷酸二酯键中的一个氧换成硫（硫代磷酸酯），抵抗核酸酶降解，还能让药物与血液中的蛋白结合、不被肾脏快速清除。ASO 和 siRNA 普遍使用。
• 糖环修饰：在核糖的 2′ 位加上甲氧基（2′-O-甲基）、氟（2′-F）或甲氧乙基（2′-MOE）等，同时提高稳定性、与目标的结合力，并降低免疫刺激。
• 碱基修饰：mRNA 用修饰核苷（如假尿苷、N1-甲基假尿苷）替代尿苷，大幅降低先天免疫反应、提高翻译效率。考里科和魏斯曼因这一发现获得 2023 年诺贝尔生理学或医学奖。

可以说，一个核酸药物的"序列"决定它打谁，"修饰模式"决定它能不能活着到达、会不会引起炎症。这些修饰单体和修饰核苷酸，正是核酸药物产业链上的关键原料。

10疫苗：从产业视角看"给免疫系统看什么"

M6 讲了疫苗为什么有效；这里换个角度，看每类疫苗怎么生产、需要什么原料、难在哪里。

疫苗的原理（M6）是让免疫系统先经历一次"演习"、留下记忆细胞。从产业角度看，疫苗和治疗性药物有几个显著不同：它给健康人使用，所以对安全性的要求极高；往往要给成千上万甚至上亿人接种，产量巨大、每剂成本必须很低；很多疫苗含佐剂（如铝盐等能增强免疫反应的成分）；而且很多国家对疫苗实行逐批审核，例如中国的"生物制品批签发"制度，每一批疫苗都要经过国家指定机构审核检验才能上市销售。不同类型的疫苗，生产平台差别很大：

11动手工具：药物模态对比器

把前面学过的七种模态放在一起比一比。所有描述均为定性概括，具体产品会有差异。

12产业链与原料：一个新药背后有多少环节

从一段基因序列到医院里的一支药，要经过研发工具、工艺开发、GMP 生产、临床试验和商业化。

粗略地说，产业链分三段。上游是研发工具与原料：基因合成、质粒构建、研究用蛋白和抗体试剂、抗体发现与优化、细胞株与培养基、工具酶、层析填料和耗材，服务对象是正在做研究的科学家。中游是工艺开发与 GMP 生产，CDMO 主要在这里：细胞株开发、抗体药工艺开发与放大、GMP 级质粒和病毒载体生产、抗体与 mRNA 原液生产、制剂灌装和放行检测。下游是临床与商业化：I–III 期临床试验、药品注册审批、上市销售、医院给患者用药（例如为患者回输 CAR-T）以及上市后安全监测。

理解产业链的一个关键点：质量等级随阶段升级。同样是质粒，早期研究用"研究级"就够了；进入临床前研究，常需要更高质量等级的产品；生产临床用的病毒载体或 mRNA 时，质粒作为起始物料，需要在符合 GMP 要求的条件下生产，并提供完整的质量文件。客户项目每往前走一步，对供应商的要求就上一个台阶。

从靶点到商业化：一个新药要过几道关

把产业链按时间展开，一个生物药大致要经过以下环节（各阶段的细节和法规在 M8 详细讲）：

1. 靶点发现与验证：找到和疾病相关、"打了它能治病"的分子，例如某个受体或某个突变基因；
2. 先导分子发现：针对靶点筛选候选药物，例如抗体发现、核酸序列设计、CAR 设计，需要大量基因合成、蛋白和抗体试剂；
3. 分子优化与候选确定：提高亲和力、稳定性和可生产性（"成药性"），选定一个候选分子；
4. 临床前研究与 CMC 开发：动物药理、毒理研究，同时开发细胞株、工艺和分析方法，生产临床前和临床用样品；
5. 新药临床试验申请（IND）与临床试验：I 期看安全性，II 期初步看疗效和剂量，III 期大规模确认疗效；
6. 上市申请与审批：向监管机构提交全部数据（生物药在美国叫 BLA），获批后才能上市；
7. 商业化生产与上市后监测：稳定、大规模地生产，持续监测安全性。

CRO、CDMO、CMO 有什么区别？

药企很少自己完成所有环节，很多工作交给外包服务商。按服务内容，主要分为三类：

药企为什么要外包，第 03 节已经讲过：建厂贵且慢、外包方经验丰富、产能可以按需使用、新模态门槛更高。现实中三者的边界并不绝对，很多公司同时提供多类服务；客户找 CDMO 时，往往希望"一个合作方把从细胞株到临床样品的事情都接住"，减少工艺转移的次数和风险。

关键原料：药是用什么"做"出来的

按模态看，各自"最卡脖子"的原料也不同：

• 抗体 / 蛋白药：高表达稳定细胞株、化学成分确定的培养基、Protein A 等层析填料、一次性袋子和滤器。
• ADC：高纯度抗体中间体、连接子-毒素（高活性化学品）、偶联与高活性物质防护能力。
• CAR-T：GMP 级病毒载体（及其生产所需质粒）、细胞激活试剂、无血清培养基与细胞因子、冷链。
• AAV / 慢病毒：大量高质量质粒（三质粒或四质粒体系）、HEK293 细胞、转染试剂、纯化填料、空实壳分析能力。
• mRNA：线性化质粒模板、T7 RNA 聚合酶、加帽试剂、修饰核苷酸、可电离脂质等 LNP 原料。

可以看出，质粒几乎是所有新模态共同的起点。这也是"质粒"这个看似基础的产品，在细胞与基因治疗时代变得格外重要的原因。

集团在链上的位置（概念层面）

以下只做概念层面的介绍，具体业务范围、能力和数据以公司官方信息为准。

把这几块业务放到上面的产业链上看：一个细胞或基因治疗项目，可能在研发阶段需要基因合成和质粒，在走向临床时需要 GMP 级质粒和病毒载体生产，最终成为像 Carvykti 这样的上市产品。理解客户所处的阶段，就能理解他现在关心什么、下一步可能需要什么。

13联系工作：客户的话怎么听

把本模块的知识翻译成"客户一句话背后的意思"。以下为常见场景的概念性归纳。

听客户说话时，可以按三个问题来定位：他在做哪种模态（抗体、ADC、CAR-T、AAV、mRNA……），项目走到了哪个阶段（研究、临床前、临床、商业化），以及他卡在哪个环节（分子设计、表达、纯化、载体包装、分析检测、质量文件）。三者一交叉，需求就清楚了。

客户的话怎么听

14术语卡片：点击翻面

先看正面自己解释一遍，再翻过来核对。

15模块测验

14 道题，答完自动计分，成绩会记录在课程首页。

延伸资源

• FDA 官网"Approved Cellular and Gene Therapy Products"：美国已批准的细胞和基因治疗产品清单，每个产品都附有说明书，可以对照本模块的 CAR-T 和 AAV 案例阅读。
• CAR-T、ADC、mRNA 作用机制动画：在 B 站或视频网站搜索"CAR-T mechanism of action""ADC mechanism of action""mRNA vaccine how it works"，很多药企和科普机构都制作了直观的动画。
• 《基因传：众生之源》（悉达多·穆克吉 著）：后半部分讲述基因治疗的起落、基辛格事件与基因编辑，是本模块很好的"故事版"补充。
• 诺贝尔奖官网：阅读 2006（RNA 干扰）、2018（免疫检查点）、2020（CRISPR）、2023（mRNA 核苷修饰）几届奖项的科普介绍。
• 工作练习：浏览蓬勃生物的公开服务介绍，把每项服务对应到本模块的模态（抗体、病毒载体、质粒、细胞治疗等）和生产环节（上游、下游、制剂、检测）。